鼠妇提取物对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

段哲萍 于新江 李 芳 李菁菁 赵 娟

(河北省人民医院肿瘤二科，河北 石家庄 050051)

鼠妇提取物对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

段哲萍 于新江1李 芳2李菁菁3赵 娟3

(河北省人民医院肿瘤二科，河北 石家庄 050051)

目的探讨鼠妇水提取物及乙酸乙酯提取物对骨桥蛋白(OPN)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法采用细胞培养、流式细胞术、MTT等方法，观测鼠妇不同浓度的水及乙酸乙酯提取物分别在基础培养情况下及OPN诱导的条件下针对VSMC凋亡、增殖、迁移的影响作用。结果①OPN组及各浓度鼠妇水提取物、鼠妇乙酸乙酯提取物对于晚期平滑肌细胞的凋亡无影响。②不加入OPN刺激时，鼠妇水提取物对于细胞增殖起促进作用，且随着鼠妇水提取物浓度的增加，促进作用增强，呈剂量依赖性。鼠妇乙酸乙酯提取物抑制细胞增殖，鼠妇乙酸乙酯提取物各浓度的增加，抑制作用加强，呈剂量依赖性。给予OPN作用细胞后，两种提取物均发挥抑制细胞增殖作用。③OPN组、OPN+低浓度(0.5 mg/ml)鼠妇水提取物组、OPN+高浓度(1.00 mg/ml)鼠妇乙酸乙酯提取物组均可使细胞迁移数量增多，均有促细胞迁移的作用，其中OPN组迁移的细胞数量最多，OPN+低浓度鼠妇乙酸乙酯提取物组、OPN+高浓度鼠妇水提取物组次之。结论鼠妇提取物作为一种纯生物制剂，对于正常生长和刺激增殖后的平滑肌细胞作用是不同的；其对动脉粥样硬化的发生发展变化的抑制作用不是通过促进细胞凋亡来实现的。

鼠妇提取物；血管平滑肌细胞；细胞增殖；细胞迁移

血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及其向血管内膜下迁移是动脉粥样硬化性心脏病、高血压、血管成形术后再狭窄等血管重塑相关性疾病的重要病理学基础。研究表明〔1〕，多种细胞外基质(ECM)成分和生长因子都对VSMC的黏附、迁移及增殖过程起到参与和调节作用，例如骨桥蛋白(OPN)、纤连蛋白(FN)等等。血管炎性增生致使血管管腔狭窄，这种血管的重塑性是引起缺血性心脏病的重要病因之一。鼠妇属节肢动物门甲壳纲潮虫亚目潮虫科，可通过抑制环氧化物酶(COX)而发挥抗炎功效〔2～5〕。但鼠妇对于血管炎性增生条件下VSMC增殖和迁移的影响尚未见相关文献。本研究探讨鼠妇提取物对OPN刺激诱导的VSMC的凋亡情况、迁移增殖的作用。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠1只，体质量90～100 g，动物许可证号SCXK(冀)-1-003，河北医科大学实验动物中心提供。主要试剂：改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS，Gibco公司)，噻唑蓝(MTT)和OPN(Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sandland公司)。鼠妇两种提取物(河北中医学院药学院制备、鉴定、浓度测定，李爱英教授赠送)。主要仪器：普通光学显微镜CXZLFS1(Olympus公司)，倒置显微镜XDS-1B(Olympus公司)，MCO175 CO2恒温培养箱(SANYO公司)，酶标仪ELX800型(Bio-Tek公司)，形态学图像分析系统801系列(江苏捷达科技发展有限公司)，流式细胞仪FACSTAR Calibur型(BD公司)。

1.2细胞培养 使用贴块法，常规分离及培养大鼠主动脉VSMC。首先向SD大鼠腹腔内注射25%乌来糖1～2 ml进行全身麻醉，成功麻醉后自主动脉弓至腹主动脉分叉处之间将血管离断，取下后放入含10% FBS的DMEM培养基，去除血管周围多余的脂肪并冲洗管腔内残留的多余血液，清洗干净后，血管转移浸泡至新的10% FBS的DMEM培养基，纵向剪开血管壁，后血管壁剪碎成若干1.0 mm×1.0 mm的小片；剪好的血管小片分成3份，分别贴于干净的小培养瓶壁上，倒置于37℃、5% CO2恒温培养箱中，瓶中加入含FBS的DMEM培养液，孵育2～3 h，使贴块稳固贴于培养瓶壁上；反转培养瓶，充分浸润贴壁的血管小片，定期显微镜下观察细胞长势；2～3 d更换一次培养液，5～7 d后将原代细胞消化后进行传代。

1.3细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取培养3～5代的对数生长期SD大鼠主动脉平滑肌细胞，随机分为8组，每组5瓶。对照组仅加入细胞，OPN组加入20 μg/ml OPN，OPN+鼠妇水提取物0.5、1.0、2.0 mg/ml组分别加入20 μg/ml OPN及0.5、1.0、2.0 mg/ml鼠妇水提取物，OPN+鼠妇乙酸乙酯提取物0.25、0.50、1.00 mg/ml组分别加入20 μg/ml OPN及0.25、0.50、1.00 mg/ml鼠妇乙酸乙酯提取物。各组均置于培养箱中继续温育24 h，分别收集各组细胞，PBS清洗细胞2～3次，常温离心机下离心6 min(2 000 r/min)，弃上清，70%乙醇固定好细胞，置振荡器混匀，4℃冰箱密封保存。7 d内于河北医科大学第四附属医院实验中心进行流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.4细胞增殖情况检测 采用MTT法。取3～5代的对数生长期SD大鼠主动脉平滑肌细胞，稀释后调整细胞密度为5×104个/ml，96孔板接种，将细胞随机分为8组，分组及处理方法同1.3。空白组即调零孔设置(培养基、MTT、DMSO)，对照孔设置(细胞、培养基、MTT、DMSO)，OPN组(细胞、OPN、培养基、MTT、DMSO)，实验孔(细胞、OPN、不同浓度鼠妇水提取物及鼠妇乙酸乙酯提取物、培养液、MTT、DMSO)。各组均置于培养箱中继续温育24 h，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h，去除上清，终止细胞培养；接种的每孔分别加入150 μl DMSO，为充分溶解结晶物将96孔板放置于摇床上低速振荡15 min，酶联免疫检测仪测定并记录490 nm波长处各孔吸光度值(A值)。

1.5细胞迁移情况检测 采用划痕实验。收集培养3～5代的对数生长期SD大鼠主动脉平滑肌细胞，调整细胞密度为5×104个/ml，接种于6孔板(内置预先包被的载玻片)。待细胞生长至100%汇合时，于6孔板中取出载玻片，用无菌吸头在载玻片上进行划痕。PBS洗净掉划痕中被刮下的细胞，将玻片重新置于培养液中培养，随机分为对照组、OPN组、OPN+低浓度0.5 mg/ml鼠妇水提取物组、OPN+高浓度1.00 mg/ml鼠妇乙酸乙酯提取物组，每组2孔。各组均置于培养箱中继续温育24 h，低倍显微镜下观察细胞迁移数量，计数各组迁移细胞的数量，以此代表细胞的迁移活性程度。

1.6统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行方差分析。

2 结 果

2.1晚期细胞凋亡 OPN组及OPN+各浓度鼠妇水提取物组、OPN+各浓度鼠妇乙酸乙酯提取物组细胞凋亡无统计学差异(Pgt;0.05)。凋亡率分别为OPN组(1.580 0±0.100 00)、OPN+鼠妇水提取物0.5 mg/ml组(1.633 3±0.251 66)、OPN+鼠妇水提取物1.0 mg/ml组(1.653 3±0.283 08)、OPN+鼠妇水提取物2.0 mg/ml组(1.456 7±0.060 28)；OPN+乙酸乙酯提取物0.25 mg/ml组(1.413 3±0.032 15)、OPN+乙酸乙酯提取物0.50 mg/ml组(1.546 7±0.098 66)、OPN+乙酸乙酯提取物1.00 mg/ml组(1.786 7±0.568 98)。

2.2细胞增殖 在不加入OPN刺激时，鼠妇水提取物对于细胞增殖起促进作用，且随着鼠妇水提取物浓度(0.5、1.0、2.0 mg/ml)的增加，促进增殖作用增强(0.605 67±0.021 127、0.813 00±0.036 592、1.168 33±0.187 164)，呈剂量依赖性，空白组(0.369 33±0.003 055)和对照组(0.464 67±0.017 039)无统计学差异，对照组与鼠妇水提取物0.5 mg/ml组无统计学差异，而空白组与各浓度鼠妇水提取物组均有统计学差异(Plt;0.05)。鼠妇乙酸乙酯提取物对细胞增殖起抑制作用，且随浓度(0.25、0.50、1.00 mg/ml)的增加，抑制增殖作用逐渐增强(0.740 00±0.025 239、0.568 33±0.131 838、0.392 00±0.030 610)，呈剂量依赖性。空白组(0.317 33±0.012 055)和对照组(0.686 33±0.008 021)、鼠妇乙酸乙酯提取物组(0.25、0.50 mg/ml)有统计学差异(Plt;0.05)，对照组与鼠妇乙酸乙酯提取物0.50、1.00 mg/ml组有统计学差异(Plt;0.05)。给予OPN刺激诱导细胞后，鼠妇两种提取物均发挥细胞增殖抑制作用，空白组(0.019 67±0.004 726)、对照组(0.222 00±0.005 292)与OPN组(0.277 67±0.001 155)、OPN+2.0、1.0、0.5 mg/ml鼠妇水提取物组(0.264 67±0.003 055、0.252 33±0.003 215、0.237 33±0.006 658)之间均有统计学差异(Plt;0.05)。空白组、对照组、OPN组及OPN+各浓度(1.00、0.50、0.25 mg/ml)鼠妇乙酸乙酯提取物组(0.226 67±0.001 528、0.255 33±0.005 033、0.265 33±0.005 033)均有统计学差异(Plt;0.05)。OPN+0.50 mg/ml及OPN+1.00 mg/ml鼠妇乙酸乙酯提取物组对细胞增殖抑制最明显(Plt;0.05)。

2.3细胞迁移 OPN组〔(161.67±3.786)个〕、OPN+0.5 mg/ml鼠妇水提取物组〔(124.00±5.292)个〕、OPN+1.00 mg/ml鼠妇乙酸乙酯提取物组细胞迁移〔(112.33±2.517)个〕增多，对照组〔(99.67±6.506)个〕与OPN组、OPN+1.00 mg/ml鼠妇乙酸乙酯提取物组、OPN+0.50 mg/ml鼠妇水提取物组有统计学差异(Plt;0.05)。

3 讨 论

血管重塑类疾病如高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、血管成形术后再狭窄的重要细胞病理学改变与VSMC表型的转化、黏附、迁移、细胞增殖、ECM均密切相关。病理改变过程中，VSMC黏附、进而沿血管内膜下迁移并定位增殖，造成血管炎性增生，引起血管重塑，这一复杂的病理改变过程受控于细胞与ECM之间相互作用的微细调整的动态平衡。同时，多种生长因子和许多ECM内成分如OPN、FN等等均参与VSMC黏附、增殖、迁移的调节过程中。鼠妇也称鼠负、负蟠、鼠姑、地虱等，因此虫喜栖阴暗潮湿的地方，与鼠习性类似，其背委曲，如有所负，故名鼠负。《本草纲目》中有描述鼠妇具有破瘀血、通经络及平喘、解毒、利尿、止疼等多种药用功能。动物实验研究报道：鼠妇可以治疗小鼠心律失常，减轻大鼠的疼痛，减轻小鼠炎症反应等等〔6～18〕。目前临床有报道利用鼠妇制剂治疗痔疮、皮肤疣、晚期恶性肿瘤癌痛、手术后疼痛、口腔炎、扁桃体炎、慢性支气管炎、肝癌黄疸及腹水得到良好效果〔6～18〕。目前研究发现血管炎性反应增生，导致管腔狭窄，造成缺血性心脏病。而鼠妇可经由抑制环氧化物酶(COX)起到减轻炎症的作用，参与血管重塑性疾病的发生和发展的整个过程中〔19,20〕。本研究提示无论是鼠妇水提取物还是乙酸乙酯提取物，对于OPN刺激后的平滑肌细胞迁移都是有抑制作用的。

综上，鼠妇作为一种纯生物制剂，对于正常生长和刺激增殖后的平滑肌细胞作用是不同的。生物制剂或一些经典的中成药物往往对于临床的病理变化具有双向调节作用，而这种作用目前机制不明，可能与药物浓度不同，或是不同溶剂提取的有效成分不同有关，需更深入研究证实。鼠妇提取物对于动脉粥样硬化的发生发展过程具有一定抑制及减缓作用的，而这种抑制不是通过增加细胞凋亡来实现的。

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〔2016-07-27修回〕

(编辑 苑云杰)

R361

A

1005-9202(2017)22-5541-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.023

河北省中医药管理局中医药类科研计划课题(2015138)；河北省教育厅青年基金项目(2011177)

1 河北省人民医院心脏外科 2 河北省人民医院风湿免疫科

3 河北医科大学

段哲萍(1975-)，女，主治医师，硕士，主要从事肿瘤研究。