促红细胞生成素皮下注射对跟腱损伤愈合影响的机制研究

●厉勇 叶海霞 张建新

促红细胞生成素皮下注射对跟腱损伤愈合影响的机制研究

●厉勇 叶海霞 张建新

目的：促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)具有促进损伤组织修复作用。通过观察EPO局部注射对大白兔跟腱断裂早期愈合的影响，为临床应用提供实验依据。方法：36只新西兰大白兔随机分成2组，分别为对照组和实验组各18只。取右后下肢跟腱附着点上方2cm左右，切断跟腱建立跟腱损伤模型，采用改良kessler法缝合跟腱断端，缝合处放置生物降解膜包裹，皮肤缝合后石膏固定右侧下肢为跖屈位。术后实验组右后肢皮下注射重组促红细胞生成素，对照组则注射同等容量的生理盐水，时间均为7天，1／日。术后各组分批次2周、4周、6周处死新西兰大白兔(4只、4只、10只)，分别对跟腱周围组织进行粘连分级，各时间段各取4只跟腱断端进行组织病理学检测(H&E染色，Masson染色，免疫组化分析)，统计学分析组织的成纤维细胞数目、胶原纤维含量。对余下两组各6只标本进行肌腱的生物力学拉力测试并统计学分析。结果：大白兔均存活至实验完成。随着时间延长，各组大白兔跟腱水肿逐渐减退，滑动性逐渐改善；术后3周内各组跟腱粘连逐渐加重，4周时减轻，1、4周时各组跟腱粘连程度分级差异均无统计学意义(P＞0.05)。术后1周EPO组炎性细胞浸润、毛细血管及胶原纤维增殖较空白对照组、PPP组明显，之后炎性反应及毛细血管生成逐渐减少。各时间点各组均可见Ⅰ型胶原纤维阳性表达，术后1、2、3周EPO 组Ⅰ型胶原纤维阳性密度值多于空白对照组和PPP组(P＜0.05)，4周时3组差异无统计学意义(P＞0.05)。生物力学测试：术后4周3组跟腱最大滑动距离比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；EPO 组跟腱弹性模量及最大抗拉力明显高于空白对照组及PPP组(P＜0.05)。结论：大白兔跟腱断裂早期于断端周围注射EPO能促进跟腱愈合。

促红细胞生成素；跟腱断裂；跟腱愈合Ⅰ型胶原；新西兰大白兔

促红细胞生成素(EPO)是主要由肾脏分泌的一种特异性糖蛋白类激素，结构中含有的特异性糖链结构能够与骨髓红细胞表面特异的识别受体相结合，能促进骨髓红细胞的增值与成熟，对机体血氧的供应状况发挥重要的调控作用。EPO最初是用来治疗癌症、慢性肾衰以及其他的一些疾病引起的贫血症，随着对促红细胞生成素在神经系统、运动系统以及血管壁修复、心肌疾病等方面的信号传导和作用机制的进一步深入研究，发现EPO还有一些非造血生物学的作用。例如抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、促进血管增生生长的作用，而且对平滑肌细胞、内皮细胞、骨骼肌成纤维细胞、神经元细胞等多种细胞均有表达。EPO能够刺激和促进骨髓红细胞的增值和成熟，能够增强机体肌肉组织对氧的结合、运输和供应能力，促进肌肉中氧生成，改善了机体的缺氧状态，从而使肌肉更加有力、工作时间更长。骨骼肌主要是靠有氧代谢方式供给能量，供氧能力可以直接影响骨骼肌的工作效率，因此EPO的应用可以提高血红蛋白的携氧能力，从而提高骨骼肌的工作效率。近年的国外有实验证明EPO在多种脏器如肾脏，肠道，和骨骼肌能够诱导细胞的增殖，促进毛细血管的增生，还能提高早期的软骨钙化和骨折愈合，能够增强骨骼的机械强度。由于促红细胞生成素具有这些抗凋亡、保护再生、促进血管生长的作用，伴随着随着临床基础研究的更进一步的深入，EPO的应用会更加广泛。

1 材料与方法

(1)生物力学检测：采用BOSE ElectroForce 3510高精度生物材料试验系统(美国)，比较各实验组标本力学指标。术后第6周末切取新西兰兔右侧下肢尽量完整的跟腱，0.9%NaCl溶液纱布包裹，冰柜冰冻保存。拉力测试前摄氏20度自然解冻。新西兰兔跟腱标本进行最大生物拉力(速度设定在20mm／min)测试，直至肌腱断裂所示的拉力数值，为肌腱最大抗拉力值。

(2)跟腱标本粘连度评分：采用Hitchcock粘连分级量表对各标本进行评分。

(3)H&E染色观察：统计成纤维细胞以及炎性细胞计数。

(4)Masson三色染色观察：对比纤维形态。Masson三色染色后，显微镜下观察，肌腱正常胶原纤维染成蓝色，整齐排列，肌纤维、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。

(5)免疫组化分析：对比每组标本VEGF，Collegen-1,Collegen-2,CD31, RANKL,OPG的表达情况。

(6)所有数据资料均采用SPSSl7.0统计软件进行分析与处理。定量资料若符合正态分布、方差齐性则进行T检验，用均数±标准差(s)表示；定性资料采用秩和检验，a=0.05；2周、4周、6周两组采用单因素方差分析进行各组组内纵向比较。

2 结果

2.1 一般情况

各组大白兔均存活至实验完成。大白兔切口均愈合良好；术后1～2d精神差，活动少，3d时行走跛行，1周后恢复正常行走。

2.2 大体观察

术后1周，各组跟腱及腱周组织发生水肿，与其周围组织轻度粘连，跟腱两断端见少量新生纤维组织，与周围疏松组织界限不清。2周时，各组跟腱及其周围组织水肿较前减退，粘连较1周时无明显变化，两断端由纤维组织连接，滑动性差。3周时，各组跟腱无明显水肿，粘连范围较前增加，但易分开，无明显滑动性。4周时，跟腱与周围组织粘连较3周时明显减轻，与1、2周时跟腱粘连无明显差异，跟腱滑动性明显改善，跟腱比1周时增粗；空白对照组跟腱粘连最严重。术后1、4周时各组跟腱粘连程度分级比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 组织学观察

术后1周，镜下见各组胶原纤维排列疏松、散裂，组织间水肿，炎性细胞浸润；可见胶原纤维增殖，组织间有新生毛细血管，EPO组胶原纤维增殖及新生血管均优于其他两组(图1)。2、3周时，各组组织水肿较1周时减轻，炎性细胞减少，仍可见排列紊乱的胶原纤维组织，胶原组织间毛细血管较1周时减少。4周时，各组组织间水肿消退，跟腱炎性反应基本消退，但空白对照组仍可见少量炎性细胞；胶原纤维排列较前整齐，各组毛细血管较1周时减少；与空白对照组及PPP组比较，EPO组胶原纤维排列致密，胶原纤维细胞数减少，细胞呈细长形，核变小，排列规律；PPP 组细胞核深染，胶原纤维可见褶皱，走行不平整(图2)。

2.4 免疫组织化学染色观察

术后各时间点各组均可见阳性染色，其中1～3周时EPO组阳性染色纤维多于空白对照组和PPP组(图3)，4周时3组无显著差异(图4)。术后1、2、3周，EPO组Ⅰ型胶原纤维阳性密度值均高于空白对照组及PPP组，差异有统计学意义(P＜0.05)；除1周时PPP组与空白对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)外，2、3周时PPP组均高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。术后4周3组Ⅰ型胶原纤维阳性密度值比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 生物力学试验

术后4周EPO组跟腱弹性模量及最大抗拉力明显高于空白对照组及PPP组，差异有统计学意义(P＜0.05)，空白对照组和PPP组间差异无统计学意义(P＞0.05)。3组跟腱最大滑动距离比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

跟腱损伤是运动系统的最常见疾病之一，随着人群对健康的越来越重视，导致发病率逐步上升。由于跟腱中段血液循环较差和跟骨结节上方2-6cm最为薄弱这些特殊的解剖生理学特点，损伤后的跟腱修复极为不易[1-3]。医务工作者临床上尽力保持跟腱腱鞘的的连续性和平整光滑，但术后功能的恢复欠佳。多年来人们通过大量的实验研究，探索出了许多促进肌腱愈合的方法[4]。随着分子生物学的发展和研究，文献显示有很多细胞生长因子及药物在肌腱愈合过程中发挥着重要的作用，它们在肌腱愈合的不同阶段调控细胞的增值、基质胶原合成[5-7]。

促红细胞生成素(EPO)是主要由肾脏分泌的一种特异性糖蛋白类激素，结构中含有的特异性糖链结构能够与骨髓红细胞表面特异的识别受体相结合，能促进骨髓红细胞的增值与成熟，对机体血氧的供应状况发挥重要的调控作用。EPO最初是用来治疗癌症、慢性肾衰以及其他的一些疾病引起的贫血症[8-10]，随着对促红细胞生成素在神经系统、运动系统以及血管壁修复、心肌疾病等方面的信号传导和作用机制的进一步深入研究，发现EPO还有一些非造血生物学的作用。例如抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、促进血管增生生长的作用，而且对平滑肌细胞、内皮细胞、骨骼肌成纤维细胞、神经元细胞等多种细胞均有表达。EPO能够刺激和促进骨髓红细胞的增值和成熟，能够增强机体肌肉组织对氧的结合、运输和供应能力，促进肌肉中氧生成，改善了机体的缺氧状态，从而使肌肉更加有力、工作时间更长。骨骼肌主要是靠有氧代谢方式供给能量，供氧能力可以直接影响骨骼肌的工作效率，因此EPO的应用可以提高血红蛋白的携氧能力，从而提高骨骼肌的工作效率。近年的国外有实验证明EPO在多种脏器如肾脏，肠道，和骨骼肌能够诱导细胞的增殖，促进毛细血管的增生，还能提高早期的软骨钙化和骨折愈合，能够增强骨骼的机械强度[11-13]。由于促红细胞生成素具有这些抗凋亡、保护再生、促进血管生长的作用，伴随着随着临床基础研究的更进一步的深入，EPO的应用会更加广泛[14-16]。

目前在肌腱损伤修复愈合的过程中对成纤维细胞生长因子(bFGF)及血管内皮生长因子(vEGF)等多种生长因子的作用研究较多，也取得了不错的结果。体内外实验均表明这些生长因子在肌腱愈合中起着积极的作用，但对EPO在肌腱愈合中的作用未见有试验研究，此药物在肌腱愈合的过程中是如何发挥作用的都还需要进行实验研究。本课题实验将重组促红细胞生成素(rllEPO)应用于损伤的跟腱，检测其对跟腱内源性愈合的作用，并进行试验对比。希望通过本实验了解rhEPO是否起着促进肌腱的内源性愈合的作用，或者在肌腱愈合的不同阶段，作用会有什么变化，探讨其对肌腱愈合的作用，为进一步研究生长因子及将来更好地将次药物应用于临床提供动物实验及理论依据。

本研究组织学观察结果表明，术后1周EPO组跟腱实质内新生血管较其他两组增多、炎性细胞少，成纤维细胞增殖、胶原分泌以及胶原纤维数量亦较多。盛加根等[20]研究发现，在肌腱愈合初期于肌腱断端使用外源性bFGF能改善肌腱实质内bFGF低水平状态，促进细胞增殖及刺激肌腱内血管的生成。EPO中因含有各种生长因子综合作用有关，一方面刺激了瘢痕组织生成，另一方面促进血管生成有利于损伤组织修复，从而减少了瘢痕组织形成。Taylor等[23]的系统评价认为EPO能促进运动引起的肌腱和韧带损伤恢复，但只纳入了3篇研究。Schepull等[24]的一项临床随机对照研究认为EPO对促进跟腱断裂的愈合无明显作用，该研究中的指标测量时间分别为术后7、19、52周。本研究结果表明，在跟腱断裂后1周EPO能明显促进跟腱愈合，4周时则无此表现。因此，根据以往文献研究及本研究结果，我们认为PRP在跟腱愈合早期(＜4周)可能具有促进跟腱愈合作用，EPO在跟腱断裂4周以后的相关作用还有待进一步研究。

(作者单位：浙江省青田县人民医院骨科)

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EFFECT OF Erythropoietin INJECTION ON EARLY HEALING OF Achilles TENDON RUPTURE IN

Li yong ye hai xia zhangjianxin .
Department of Trauma and Orthopaedics, Qingtian people’s hospital, lishui zhejiang, 323900, P.R.China.

Objective Erythropoietin (EPO) can promote wound healing. To observe the effect ofEPO injection on the early healing of white rabbit’s Achilles tendon rupture so as to provide the experimental basis for clinicalpractice. Methods Forty-six Sprague Dawley white rabbits were included in this experiment, female or male and weighing 190-240 g. EPO and platelet-poor plasma (PPP) were prepared from the heart arterial blood of 10 rats; other 36 rats were made themodels of Achilles tendon rupture, and were randomly divided into 3 groups (control group, PPP group, and PRP group),12 rats for each group. In PPP and PRP groups, PPP and PRP of 100 μL were injected around the tendons once a week,respectively; in the control group, nothing was injected. The tendon tissue sample was harvested at 1, 2, 3, and 4 weeks afteroperation for morphology, histology, and immunohistochemistry observations. The content of collagen type I fi bers also was measured. Specimens of each group were obtained for biomechanical test at 4 weeks. Results All the animals survived till the end of the experiment. Tendon edema gradually decreased and sliding improved with time. The tendon adhesion increasedsteadily from 1 week to 3 weeks postoperatively, and it was relieved at 4 weeks in 3 groups. There was no signifi cant diff erencein the grading of tendon adhesion among 3 groups at 1 week and at 4 weeks (P ＞ 0.05), respectively. The infl ammatory cellinfi ltration, angiogenesis, and collagen fi bers were more in PRP group than in PPP group and control group at 1 week; withtime, infl ammatory cell infi ltration and angiogenesis gradually decreased.Positive staining of collagen type I fi bers was observedat 1-4 weeks postoperatively in 3 groups. The positive density of collagen type I fi bers in group EPO was signifi cantly higher thanthat in control group and PPP group at 1, 2, and 3 weeks (P ＜ 0.05), but no signifi cant diff erence was found among 3 groups at4 weeks (P ＞ 0.05). The biomechanical tests showed that there was no signifi cant diff erence in the maximal gliding excursionamong 3 groups at 4 weeks postoperatively (P ＞ 0.05); the elasticity modulus and the ultimate tensile strength of EPO group weresignifi cantly higher than those of control group and PPP group at 4 weeks (P ＜ 0.05). Conclusion EPO injection can improvethe healing of Achilles tendon in early repair of rat’s Achilles tendon rupture.

Rabbit Achilles tendon rupture early in the end of the injection of EPO can promote Achilles tendon healing