H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

董斌+陈海超 杨伦 耿文学 熊晓妍 孙兴臣+李敏婕+陈闻+蒋家森

摘要：为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列，合成HA基因；定向克隆到原核表达载体pET-32a（+）的多克隆位点中，构建重组原核表达质粒pET-32a（+）-HA；转化入大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示，重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确；重组的HA融合蛋白约为84 ku，大小与预期融合蛋白大小一致；重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合，与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得重组HA融合蛋白表达。

关键词：H7N9禽流感病毒；HA基因；pET32a（+）；原核表达；反应原性分析

中图分类号： S852.65文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）10-0049-04

收稿日期：2015-09-01

基金项目：江苏省句容市科委项目（编号：NY2013029）；江苏省镇江市农业科技支撑项目（编号：SBK2014022021）；南京农业大学教改项目（编号：2013Y021）；南京农业大学动物医学院教育教学改革研究项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目。

作者简介：董斌（1990—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向为预防兽医学。E-mail：1135220155@qq.com。

通信作者：许家荣，教授，硕士生导师，主要从事学兽医流行病学研究、畜禽传染病防治、生物制品研制。E-mail：xjr@njau.edu.cn。[HJ]

[ZK）]

H7N9型禽流感病毒感染人事件于2013年3月底在华东地区（上海和安徽2地）率先发生，感染以迅速进展的肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和致死性转归为特点[1]。目前，已经在鸡、鸽子中检测到H7N9型禽流感病毒，但这些家禽不表现明显的临床症状。陈化兰团队在《科学通报》的最新研究显示，近期在我国导致人感染的新型H7N9流感病毒与同一时期存在于活禽市场上的H7N9流感病毒高度同源；该新型H7N9流感病毒是不同来源病毒的重组病毒，它的6个内部基因来源于H9N2禽流感病毒，HA基因来源于浙江鸭H7N3，NA基因来自韩国野生鸟类携带的H7N9；H7N9病毒的受体结合位点获得了部分人流感病毒特征的突变，病毒再感染人后获得了关键氨基酸位点的适应性突变，这可能与该病毒对人的感染和致死能力有关[2]。尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性，但已有家族式感染的报道[3]，到目前已有数名患者抢救无效死亡。

禽流感病毒在生物分类学上属正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒属（Influenzavirus A）[4-5]。A型流感病毒基因组为8个节段的单股负链RNA，编码11种功能蛋白。病毒基因组分节段的特性使流感病毒容易发生基因重排。A型流感病毒呈多形性，多为球形，然而新分离的主要为丝状。病毒直径80～120 nm。病毒粒子结构的最外层为来自于宿主细胞的双层类脂囊膜。囊膜上有3种蛋白突起（又称纤突）：血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和基质蛋白2（matrixprotein，M2），这3种突起均以疏水性氨基酸锚定在类脂膜上。中间层为基质蛋白1（M1）。最里层是呈螺旋型对称的核衣壳，含有核蛋白（neucleoprotein，NP）、3种多聚蛋白酶和病毒基因组RNA[6]。迄今为止，已知A型流感病毒的HA有16个亚型（H1-H16）[7]，NA有9个亚型（N1-N10），HA和NA之间的不同组合使A型流感病毒有许多亚型（如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等），各亚型之间无交互免疫力。其中高致病性的主要有H7和H5亚型。在A型流感病毒的8个RNA节段中，节段4编码血凝素HA。HA属于Ⅰ型膜糖蛋白，是流感病毒最重要的表面蛋白。新合成的HA在粗面内质网中进行糖基化，并在通过内质网时切除氨基端含14～18个氨基酸的信号肽。HA以同源三聚体的形式突出在囊膜表面，呈棒状，由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，包括受体结合位点和大部分的抗原位点；颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。HA 是流感病毒的主要表面抗原，能诱导机体产生保护性中和抗体[8-11]。流感病毒感染后产生能针对病毒HA、NA、M和NP蛋白的抗体，但只有针对HA顶部球形区的抗体能阻止病毒吸附到宿主细胞受体上[12]，从而中和病毒的感染力。这些抗体可以通过病毒中和试验或HI试验测定。

检测鸡血清样品中H7亚型抗体能有助于了解鸡群的感染情况，检测抗体可以用中和试验或血凝抑制（HI）试验来进行，但操作过程时间较长，影响因素多且比较繁琐，所以建立1种快速、易标准化、能同时检测大量样品的检测方法尤为迫切，例如胶体金、间接ELISA等。本次试验只进行到HA基因的原核表达以及反应原性的鉴定，检测方法的建立有待后续研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、细胞从NCBI下载此次疫情GenBank最早发布的A/Hangzhou/1/2013（H7N9）株HA全基因序列，Gen-Bank登录号为KC853766。自行设计优化，由上海捷瑞生物技术公司合成HA基因，并将其插入质粒pET-32a（+）中，构建pET-32a（+）-HA重组质粒。实验室常备大肠杆菌BL21。

1.1.2主要材料限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、10 000 bp DNA Marker、小鼠抗6× His组氨酸单克隆抗体（mAb）、辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY均购自大连宝生物工程有限公司。商品化的丽春红染色液，增强型ECL发光液，NC膜，滤纸购自北京中杉金桥生物技术有限公司。H7阳性血清来自哈尔滨兽医研究所。

1.2方法

1.2.1HA基因序列及生物信息学分析利用DNAstar中Protean进行抗原表位分析。

1.2.2重组质粒的鉴定对上海捷瑞生物有限公司合成的重组质粒pET-32（+）-HA进行双酶切鉴定。以该合成重组质粒为模板。20 μL酶切体系：质粒8 μL（100 ng/μL），10×酶切buffer 2 μL，BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，加ddH2O至 20 μL，37 ℃酶切1 h。重组质粒阳转的单菌落菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.3感受态BL21制备在LB平板上挑取大肠杆菌BL21单个菌落接种于3.0 mL LB液体培养基中 200 r/min过夜振荡培养。次日按20 μL菌液接种至3 mL新的LB培养基中 200 r/min 振荡培养3～4 h至D600 nm=0.4，将细菌移至 1.5 mL 的灭菌离心管中，离心去上液。先加200 μL CaCl2重悬菌体，再加800 μL CaCl2（冰上进行），冰浴30 min，然后 4 ℃ 12 000 r/min 离心1 min，取上液最后用100 μL CaCl2重悬细菌，即为新鲜制备的感受态BL21。

1.2.4质粒转化感受态大肠杆菌BL21取pET32a（+）-HA重组质粒，pET32a空载体各1 μL，分别加入到新鲜制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，然后置于42 ℃水浴中热休克90 s，迅速置于冰中冷却5 min，加入 800 μL LB培养基，37 ℃ 180 r/min振荡培养45 min，取 100 μL 凃布于带有氨苄抗性的平板上，37 ℃培养8 h。

1.2.5重组表达菌的IPTG诱导表达[JP2]将DNA测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）中，同时另取空载体pET-32（+）化至E.coli BL21（DE3）作对照，涂布于LB（Amp+）培养基平板，挑取单克隆菌落接种于3 mL LB（Amp+），37 ℃ 200 r/min振荡培养6～8 h，取菌20 μL至4 mL LB（Amp+）液体培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养基至D600 nm为0.8，取1 mL样品于无菌1.5 mL EP管中作为诱导前对照，向上述菌液中加入终浓度为1 mol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并对诱导时间及温度进行优化筛选。超声裂菌器裂菌。

1.2.6SDS-PAGE分析表达产物表达产物加5×SDS蛋白上样缓冲液煮沸处理后，进行SDS-PAGE分析，选用5%浓缩胶、10%分离胶，浓缩胶80 V恒定电压，分离胶120 V恒定电压，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，鉴定分析融合蛋白的诱导表达。

1.2.7重组蛋白的Western-Blot鉴定表达产物经SDS-PAGE分离后，转印至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭3 h，1 ∶[KG-*3]20 000 稀释小鼠抗6×His mAb室温3 h，4 ℃过夜，PBST洗膜3次，1 ∶[KG-*3]3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温孵育3 h，PBST洗膜3次，增强型ECL发光液显影。以重组蛋白为抗原，以商品化H7阳性血清（哈尔滨兽医研究所）为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗，增强型ECL发光液为显色液，以此来证明该蛋白的反应原性。

1.2.8曝光将涂布发光液的NC膜置于暗室进行曝光，将胶片置于显色液中显色，水中洗去显色液，再置于定影液中定影，待胶片透明定影结束，观察结果。

2结果与分析

2.1HA蛋白的亲水性和抗原性预测及表面可能性分析[HT]

利用DNAStar中Protean软件分析结果（图1）显示，HA蛋白的二级结构以α螺旋和β螺旋为主，对其抗原性及表面可能性的分析结果显示，该蛋白抗原可能位点丰富，具有良好的亲水性和疏水性。

2.2重组质粒酶切鉴定

重组质粒pET-32a（+）-HA经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，可获得大小5 900 bp的载体片段和1 609 bp的基因片段，该片段大小与HA基因片段大小相符（图2）。以空载体酶切图（图3）作为对照，双酶切鉴定正确。DNA测序结果正确。

2.3重组质粒表达分析

[JP2]HA蛋白约59 ku， 对含有重组表达质粒pET-32a（+）-HA的重组大肠杆菌BL21利用IPTG诱导表达，表达出HA-His融合蛋白，融合蛋白含有25 ku的His标签蛋白（图4）；对蛋白表达条件优化后表明，HA-His蛋白在28 ℃下1.0 mol/L IPTG[CM（19]诱导8[KG*3]h表达量最大，融合蛋白大小约为[CM）][FL）]

84 ku （图5、图6）；重组表达蛋白在包涵体和上清中都存在，在上清中表达量较高（图7）。

2.4重组融合蛋白Western-Blot 鉴定

分别采用His标签抗体和H7阳性血清对HA-His融合蛋白进行检测，结果如图8、图9所示，同种抗体均能在分量约为84 ku处检测到特异性条带，说明融合蛋白能够特异性表达，与预期结果一致。

3讨论

[CM（24]本研究通过原核表达系统表达H7亚型禽流感病毒的HA抗原，从上述SDS-PAGE、Western blot的检测结果可以得知，HA蛋白获得表达并与H7阳性血清产生良好的反应原性，重组蛋白在包涵体和上清中都存在，且上清中较多。总结本次试验，HA蛋白的二级结构以α螺旋和β螺旋为主，对其抗原性及表面可能性的分析结果显示，该蛋白抗原可能位点丰[CM（25]富，该蛋白具有良好的亲水性和疏水性。根据目的基因序列预测蛋白的大小应该为84 ku，在SDS-PAGE鉴定中显示目的蛋白条带出现在66.2～116 ku，符合预测结果，且发现低温诱导表达量大于37 ℃诱导表达量，在低温诱导时，诱导6 h与 8 h 表达量变化不大，在37 ℃诱导时，诱导4、6、8 h，表达量有明显梯度增加，时间再延长表达量变化不大。分别采用His标签抗体和H7阳性血清对HA-His融合蛋白进行检测，同种抗体均能在分子量约为84 ku处检测到特异性条带，说明融合蛋白能够特异性表达，并与H7阳性血清产生良好反应性。本研究只进行到HA基因的原核表达以及反应原性的鉴定，建立1种快速、易标准化、能同时检测大量样品的检测方法有待后续研究。

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