棉花与模式植物DGAT2基因的鉴定与分析

张晓琼++乔琳++胡利宗++廖立冰++王秋霞++解恒昌++周琳

摘要：二脂酰甘油酰基转移酶Ⅱ（DGAT2）是催化三酰甘油生物合成的关键酶，利用生物信息学手段在二倍体棉花和6种模式植物中共鉴定出25个DGAT2基因，详细剖析这些基因的结构、序列和进化特征。基因结构分析表明，绝大多数植物包含8个或9个外显子，且内含子相位高度保守，说明该基因结构起源于陆生植物。蛋白序列分析显示，核心保守基序1、2、3与功能结构域相互重叠，说明功能结构域起源于藻类植物。进化分析显示：在棉花中，DGAT2基因发生特异性扩增，其分子机制为串联重复；结合滑动窗口方法和位点模型选择压力检测结果，DGAT2蛋白均受制于负选择作用。这些结果为棉花及模式植物DGAT2的功能研究提供帮助。

关键词：二酰甘油酰基转移酶；保守基序；棉花；模式植物；进化

中图分类号： S562.03；Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0069-04

收稿日期：2015-08-28

基金项目：周口师范学院高层次人才科研启动经费（编号：ZKNU2014109）；周口师范学院大学生科研创新基金（编号：ZKNUD15037）。

作者简介：张晓琼（1991—），女，河南安阳人，硕士研究生，主要从事植物遗传学研究。E-mail：zxqxiaoqiong00@163.com。

通信作者：胡利宗，博士，副教授，主要从事植物遗传学研究。E-mail：hulizong@126.com。二酰甘油酰基转移酶（DGAT，EC 2.3.1.20）是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步的关键酶[1]。目前，在植物中存在3种类型的DGAT，即DGAT1、DGAT2和DGAT3[2]。前人研究表明，DGAT1、DGAT2和DGAT3隶属于不同基因家族，其蛋白序列相似性极低，但三者均具有二脂酰甘油酰基转移酶活性，过表达这些基因均可不同程度提高植物种子含油量[3]。前人研究显示，DGAT酶参与种子油脂合成、种子萌发与发育以及幼苗发育等众多生物学过程，具有多样化的功能[4]。自Lardizabal等成功克隆MrDGAT2基因以来，在人类、拟南芥和藻类等物种中均克隆出DGAT2基因[5-7]。DGAT2基因功能研究显示，DGAT2基因具有底物特异性，优先利用特殊脂肪酸进行三酰甘油合成[8]。因此，DGAT2基因的相关研究越来越受到人们的重视。棉花不仅是一种重要的经济作物，还是天然纤维与油料作物。虽然在棉花纤维发育、纤维品质以及抗逆性等方面开展了许多研究，但棉花DGAT2基因的研究仍未见报道。此外，二倍体雷蒙德氏棉[9]和亚洲棉[10]全基因组序列测定已经被完成，这为在棉花中研究DGAT2基因提供了数据资源。利用生物信息学手段鉴定棉花DGAT2基因，并剖析这些基因的结构、保守基序、功能结构域以及系统进化关系。这些结果能为阐明棉花油脂积累的分子机制奠定基础，为进一步研究棉花DGAT2基因的功能提供线索。

1材料与方法

1.1物种抽样与基因序列下载

本研究涉及的物种包括亚洲棉、雷蒙德氏棉和其他6种模式植物。序列下载步骤为：在NCBI数据库直接检索并下载已知的DGAT2基因序列，以这些序列为检索序列，利用BLAST工具在默认参数条件下分别搜索相关数据库CottonGen（http：//www.cottongen.org/）、Greenphyl V4（http：//www.greenphyl.org/cgi-bin/index.cgi）和Phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net/），最终获取棉花及其他模式植物的DGAT2基因。并利用Pfam工具[11]确定这些基因是否含有DAGAT（PF03982）。

1.2序列特征与蛋白特性分析

通过DNA和cDNA的比较，棉花与模式植物DGAT2基因外显子和内含子的组织结构模式被鉴定，由GSDS 2.0工具绘制[12]。MEME服务器被用于剖析棉花与模式植物DGAT2蛋白的保守基序组成模式，参数设置如下：保守基序氨基酸长度为6～180 bp；保守基序数目最大值为10；E阈值为 0.000 01，其他参数默认[13]。此外，利用HMMTOP工具剖析DGAT2蛋白的跨膜结构域的数目与位置[14]。

1.3系统进化与选择压力检测

为阐明DGAT2蛋白的系统进化关系，利用Clustal X软件[15]在默认条件下对DGAT2蛋白进行序列比对，其比对结果直接导入MEGA软件[16]中，输出进化树并进行细微调整。在进化树的末端，可鉴定出同源基因对，同时基于滑动窗口方法剖析同源基因对的选择压力，其计算由DnaSP 5.10完成，参数设置为：滑动窗口100 bp和步长10 bp[17]。此外，利用Pal2nal工具准备所有DGAT2基因的密码子比对序列[18]，利用位点特异模型对DGAT2基因进行选择压力分析，其计算过程由PAML 3.15软件包中的CODEML程序完成[19]。

2结果与分析

2.1棉花与模式植物DGAT2鉴定与蛋白序列特征

利用Blast工具在2种棉花与6种模式植物中共鉴定出25个DGAT2基因，这些基因的位点标识符、染色体、正负链位置以及基因组匹配区段均被列出（表1）。功能结构域分析表明，DGAT2基因编码的蛋白均具有典型的功能结构域DAGAT（PF03982）。聚类分析显示，2种棉花DGAT2与拟南芥和水稻DGAT2聚在一起形成了一个双子叶植物类群；低等植物DGAT2倾向于聚为一类，但有些低等植物DGAT2蛋白单独形成一个分支（图1-A）。此外，利用HMMTOP工具分析DGAT2蛋白的跨膜结构，结果显示，除PaDGAT2c外，棉花与模式植物DGAT2蛋白均具有至少1个跨膜结构域（表1）。

利用MEME软件对DGAT2蛋白的保守基序进行分析，结果表明，在25个棉花和模式植物DGAT2蛋白中存在10个保守基序（Motif1～10），共形成13种保守基序组织模式，其中6个棉花DGAT2蛋白共享的保守基序组成模式为 Motif4-6-2-1-3，而AtDGAT2、OsDGAT2a/b和PpDGAT2d等共享的保守基序模式为Motif9-6-2-1-3（图1-B）。就单个保守基序而言，所有DGAT2蛋白保守基序被分为两大类型，即种属普遍类型和种属特异类型。保守基序1、2、3、6、9几乎存在于所有DGAT2蛋白中，属于种属普遍类型；但保守基序4、5、7、8、10表现出不同程度的种属特异性，属于种属特异类型。此外，DGAT2蛋白的DAGAT（PF03982） 功能结构域与保守基序1、2、3、6、9相互重叠，这说明植物的5个保守基序均可能与DGAT2活性高度相关。

2.2棉花与模式植物DGAT2基因的外显子与内含子组成模式

通过比较DNA与CDS序列，棉花与模式植物DGAT2基因的结构特点均被阐明，并鉴定其内含子相位。根据外显子数目，这些DGAT2基因结构被分为三大类型：（1）8个外显子类型，这种类型的基因包括GrDGAT2a、GrDGAT2d和AtDGAT2等5个基因；（2）9个外显子类型，这种类型的基因包括GrDGAT2b、GaDGAT2a和OsDGAT2a等11个基因；（3）2、3、5、6、7、13个或14个外显子类型，这类基因包括CrDGAT2a、PpDGAT2b和PaDGAT2c等9个基因（图1-C）。结合DGAT2蛋白聚类结果可知，位于同一进化分支的基因往往具有相同或相似的基因结构，甚至外显子和内含子长度、内含子相位具有高度保守性；棉花DGAT2蛋白聚为一类，具有高度相似的基因结构，并且这些基因的内含子相位高度保守；此外，有些物种DGAT2蛋白单独形成一个分支，具有独特的基因结构如PaDGAT2d、CrDGAT2a和PaDGAT2b，它们分别拥有2、6、5个外显子，并且其内含子相位变异较大。总之，棉花与模式植物DGAT2基因的结构多数以8个或9个外显子形式存在，尤其是在高等植物中该基因的结构具有较高的保守性。

2.3棉花与模式植物DGAT2基因的系统进化关系

在构建棉花与模式植物DGAT2基因的进化树前，移走覆盖度低于80%、相似度低于30%的序列，进而构建由亚洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8种植物的14个DGAT2蛋白形成的进化树。系统进化分析表明，藻类植物CrDGAT2a蛋白单独形成1个进化分支，与其他植物具有较远的亲缘关系；其他苔藓类、蕨类、裸子与被子植物DGAT2蛋白明显被分为2个进化分支，其中被子植物DGAT2蛋白形成1个进化分支，藓类、蕨类和裸子植物DGAT2形成另一个进化分支（图2）。此外，在进化树末端分支上，存在4对同源基因，其中2对属于直系同源基因，2对属于旁系同源基因；旁系同源基因包括GaDGAT2b/GaDGAT2c和OsDGAT2a/OsDGAT2b，它们起源于物种特异的基因扩增；直系同源基因包括GrDGAT2c/GaDGAT2d和GaDGAT2a/GrDGAT2d，它们起源于物种分化事件（图2）。

2.4基于同源对水平的棉花与模式植物DGAT2基因的选择压力

为考察进化树末端的4对同源基因之间是否经历适应性进化，本研究利用DnaSP 5.10软件对4对DGAT2同源基因进行滑动窗口分析，参数设置：窗口尺寸为100 bp，步移长度为10 bp。结果显示，4对同源基因的ω平均值从大到小为044（GrDGAT2d/GaDGAT2a）>0.31（GaDGAT2b/GaDGAT2c）>016（OsDGAT2b/OsDGAT2a）>0.15（GaDGAT2d/GrDGAT2c）。就旁系同源基因而言，亚洲棉旁系基因对GaDGAT2b/GaDGAT2c和水稻旁系同源基因对OsDGAT2b/OsDGAT2a的每个步移窗口对应的进化速率具有异质性，但所有的步移窗口的ω值均小于1，这充分说明这2对旁系同源基因均受控于负选择作用，也揭示了基因重复之后并未发生适应性进化（图3-A）。同理，在2种棉花物种中，直系同源基因对GrDGAT2d/GaDGAT2a 和GaDGAT2d/GrDGAT2c的ω均不大于1，这说明物种分化产生重复基因受到负选择作用，这可能与功能限制密切相关（图3-B）。

2.5基于类群水平的棉花与模式植物DGAT2基因的选择压力

以亚洲棉、雷蒙德氏棉和水稻等8种植物的14个DGAT2基因为研究对象，利用位点模型对DGAT2基因进行选择压力检测，鉴定出正选择位点，并利用贝叶斯后验概率推断每个正选择位点概率值。似然比检验表明，2ΔlnL=271.62>13277（M0/M3），这说明M3极显著优于M0（P<0.01），因此，这些DGAT2蛋白位点间的进化速率明显具有异质性；就M2a和M1a比较而言，似然比检验值2ΔlnL=0<5.991，说明M2a并不优于M1a模型，DGAT2基因可能未经历适应性进化；同理，2ΔlnL=0<5.991（M7/M8），说明M8模型并不优于M7模型，进而可推知棉花与模式植物DGAT2基因中并没有鉴定到正选择氨基酸位点（表2）。结合似然比测验和贝叶斯推断分析可知，棉花与模式植物DGAT2基因均受制于负选择作用，这意味着DGAT2具有高度保守性，这可能与严格的功能限制相关。

3结论与讨论

DGAT2基因广泛存在于真菌、藻类、植物和动物基因组中，尤其是在藻类植物中通常以多拷贝形式存在[1，3，20-21]，这说明DGAT2基因起源较早，是一个古老的基因家族。与藻类植物相比，被子植物中DGAT2基因数目较少，绝大多数物种仅包括1个或2个成员。但令人感兴趣的是，在2种二倍体棉花中均发现了4个DGAT2基因，并且在2种二倍体棉花中DGAT2基因均以串联重复方式排列在同一个染色体区段内，这说明棉花DGAT2基因发生了物种特异性串联重复。基因结构和蛋白保守基序分析显示，所有物种DGAT2序列特征具有较高的多样性，但在被子植物中DGAT2基因的结构与蛋白基序均表现出高度保守性，这说明被子植物DGAT2蛋白受到严格的功能限制，具有高度相似的生物学功能，这与前人的研究结果[21-22]基本一致。此外，水稻和棉花的DGAT2同源基因对选择压力检测显示，同源基因对分化后并没有发生适应性进化。同时，基于位点模型对DGAT2蛋白进行选择压力分析，结果表明植物的14个DGAT2蛋白均受控于负选择作用，受到严格的功能限制作用[21]。总之，二倍体棉花基因组中存在4个DGAT2基因，这些基因呈现串联重复特征，并且棉花DGAT2基因受纯净选择作用，这与其功能重要性密切相关。这些结果揭示了DGAT2基因的序列特征与进化关系，为其功能研究提供了理论基础。

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