山羊miR—27a靶基因预测及生物信息学分析

陶虎++索效军++李晓峰++熊琪++张年++杨前平++刘洋++陈明新

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.016

摘要：繁殖力是决定羊养殖产业效益最重要的因素，卵泡的生长发育决定了排卵数，进而直接影响母羊的繁殖力。miRNA是由内源性基因编码的单链非编码RNA，参与靶基因的转录后调控。本研究通过对山羊miR-27a的靶基因进行预测及功能分析，为进一步研究其在山羊繁殖功能中的作用提供新途径。利用靶基因预测软件分析miR-27a的靶基因，将靶基因进行GO富集分析及KEGG信号通路分析。结果表明，预测靶基因集合分别富集在细胞增殖、转录调控、调控RNA代谢、正调控信号传导等分子功能上以及ErbB、MAPK、mTOR等信号通路中。

关键词：山羊；miR-27a；靶基因；信号通路；GO分析

中图分类号： S827.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0073-03

收稿日期：2016-04-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：31501932）；湖北省农业科学院青年科学基金（编号：2015NKYJJ14）；湖北省农业科学院竞争性计划（编号：2016jzxjh030）。

作者简介：陶虎（1986—），男，安徽合肥人，博士，助理研究员，主要从事草食家畜分子育种研究。Tel：（027）87380139；E-mail：taohu1986@hotmail.com。

通信作者：陈明新，研究员，主要从事草食家畜育种研究。E-mail：316824556@qq.com。我国是养羊大国，羊养殖产业在畜牧业中占有重要地位。繁殖和生长是决定规模化养殖产出的两大主要经济性状。在山羊中，母羊繁殖效益在总效益中占据较大比例，因此繁殖力是决定羊养殖产业效益最重要的因素之一。排卵率是产仔数性状的重要组分性状，卵巢中卵泡的生长发育决定了排卵数[1]。探索卵巢中的基因表达情况、发育规律、调控因素，对于揭示排卵率的遗传调控机制具有重要意义。

microRNA（miRNA）是由内源性基因编码的单链非编码RNA，长度一般为21～25个核苷酸（nucleotide，nt），通过与靶基因mRNA的3′-UTR互补配对来调控其转录后表达水平[2]。已有研究表明，miR-21、miR-212、miR-132在小鼠颗粒细胞中呈显著的上调表达，且当miR-21表达量降低时会导致颗粒细胞凋亡[3]。在小鼠颗粒细胞中筛选出多个受TGF-β1信号调控的miRNA，其中miR-224可靶向作用于Smad4基因来调控颗粒细胞的增殖[4]。前体miRNA发夹结构经Dicer加工形成成熟的miRNA[5]。Dicer1-/-雌鼠的卵母细胞中纺锤体发生异常，导致其不能完成第1次减数分裂[6-7]。对于颗粒细胞而言，miRNA是一类发挥重要调控作用的小分子调控物。miR-27a是miR-27家族的重要成员，该家族是 miRNA 中功能较为明显的家族之一。众多研究表明，miR-27a在疾病尤其在肿瘤中发挥重要作用，而在生殖领域鲜见报道。研究miR-27a及其靶基因转录调控，对进一步揭示miRNA对山羊母性繁殖的调控作用具有重要意义。

1材料与方法

1.1获取miRNA

从miRNA信息公共数据库miRBase（http：//www.mirbase.org/）中获取不同物种的miR-27a前体序列和成熟序列。

1.2同源性比对

利用miR-27a的前体序列，比较前体序列在不同物种间的保守程度。利用Clustal X软件进行序列比对，运用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）软件制作不同物种间miR-27a前体序列的进化树。

1.3靶基因预测

分别利用miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）、miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/index.html）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/）等靶位点分析软件分析miR-27a的靶基因和靶位点的保守性。将结果的交集作为进一步研究的基因集合，筛选3个软件均能预测到且在4种物种中均保守的靶基因作为候选靶基因。通过分析靶基因的功能进一步分析miR-27a的生物学功能。

1.4靶基因的分析

利用Gene Ontology（http：//geneontology.org/）、DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）数据库对预测得到的miR-27a靶基因进行功能富集分析，利用KEGG（http：//www.kegg.jp/）数据库进行信号通路分析，预测结果在GO类别上的高频率注释以及有统计学意义的信号调控通路。

2结果与分析

2.1miR-27a序列的获得和同源性比对

利用miRBase数据库检索到miR-27a的成熟序列，利用Clustal X在线软件进行序列比对，发现该序列在人、小鼠、大鼠、猪、马中完全一致，在牛、山羊、狗中只相差最后1个碱基，因此miR-27a的成熟序列具有很高的保守性（图1）。利用Clustal Omega软件分析上述物种的miR-27a前体序列，构建进化树。结果发现，小鼠、大鼠、猪的miR-27a前体序列比较接近，牛与山羊的比较接近（图2）。

2.2miR-27a靶基因预测

利用miRNA靶基因预测软件miRanda、miRDB、TargetScan（表1）进行靶基因联合预测，分别得到miR-27a靶基因为8 902、697、786个。筛选3种软件预测结果的交集（共390个），作为进一步分析的基因集合（图3）。

3结论与讨论

miRNA是一种非编码的小RNA，通过与靶基因3′-UTR特异性结合，从而抑制转录后基因的表达，在调控细胞周期、基因表达、生殖发育等过程中具有重要作用[8]。miRBase数据库至今已收录的miRNA达24 521条，为本研究奠定了基础。

目前，miRNA的研究已取得了很大进展，对于各种生命活动的调控作用也进行了大量研究。GO富集分析、KEGG信号通路分析等生物信息学分析技术的出现对miRNA的研究起到了关键性的支持作用，帮助研究者从海量的miRNA数据中筛选出有价值的信息。Gene Ontology可分为分子功能、生物过程、细胞组成3个部分。蛋白质或基因可通过ID对应或序列注释的方法找到与之对应的GO号，从而进行功能类别或细胞定位[9]。KEGG信号通路分析能够将特定miRNA靶基因的信号通路进行整合归类，也可设定相关参数，根据实际需要对结果进行提取[10]。

miR-27a研究的常规思路是通过靶基因预测网站（miRGen、TargetScan等），利用已知的miRNA来预测下游靶基因。利用上述预测手段得到可能与之作用的miRNA，通过合成miRNA的类似物和抑制物，与所构建靶基因的荧光载体共转染细胞，确定能够被miR-27a显著下调的靶基因，从而完成验证。

miR-27a的靶基因参与了细胞增殖、转录调控、调控RNA代谢、正调控信号传导等一系列重要的生命活动过程，预示miR-27a在山羊繁殖过程中可能发挥着重要的作用。

参考文献：

[1]张春艳. 山羊繁殖性状的影响因素和遗传规律及分子调控机制研究[D]. 武汉：华中农业大学，2010.

[2]Gu S，Jin L，Zhang F，et al. Biological basis for restriction of microRNA targets to the 3′untranslated region in mammalian mRNAs[J]. Nat Struct Mol Biol，2009，16（2）：144-150.

[3]Carletti M Z，Fiedler S D，Christenson L K. MicroRNA 21 blocks apoptosis in mouse periovulatory granulosa cells[J]. Biol Reprod，2010，83（2）：286-295.

[4]Yao G，Yin M，Lian J，et al. MicroRNA-224 is involved in transforming growth factor-beta-mediated mouse granulosa cell proliferation and granulosa cell function by targeting Smad4[J]. Mol Endocrinol，2010，24（3）：540-551.

[5]Park J E，Heo I，Tian Y，et al. Dicer recognizes the 5′ end of RNA for efficient and accurate processing[J]. Nature，2011，475（7355）：201-205.

[6]Murchison E P，Stein P，Xuan Z，et al. Critical roles for Dicer in the female germline[J]. Genes Dev，2007，21（6）：682-693.

[7]Tang F，Kaneda M，OCarroll D，et al. Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development[J]. Genes Dev，2007，21（6）：644-648.

[8]Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature，2004，431：350-355.

[9]崔晓钢. 基于RNA-seq与small RNA-seq进行奶牛产奶性状功能基因挖掘及生物信息学预测牛新miRNA[D]. 北京：中国农业大学，2015.

[10]杨洋，阚清，张盼，等. miRNA-126*靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析[J]. 中国当代儿科杂志，2013，15（3）：227-232.