海滨锦葵耐盐基因KvSOS1的克隆与表达载体构建

王红艳++王鸿磊

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.017

摘要：为了克隆盐生植物海滨锦葵耐盐基因KvSOS1并构建其表达载体，采用RT-PCR和RACE方法从海滨锦葵中克隆了质膜Na+/H+转运蛋白基因KvSOS1（GenBank登录号KJ577576）的全长cDNA序列，长度为3 850 bp，其中开放阅读框长度为3 444 bp。KvSOS1基因编码1个由1 147个氨基酸残基组成的蛋白，分子量为127.56 ku，理论等电点pI为6.18。疏水性分析结果表明，该蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11个跨膜区，C-末端为1个长约700个氨基酸残基的亲水性尾巴位于细胞质中。KvSOS1基因编码蛋白与雷蒙德氏棉、可可和陆地棉SOS1蛋白的氨基酸序列同源性很高，分别为86%、82%和82%。系统进化树分析显示KvSOS1基因编码蛋白与质膜Na+/H+转运蛋白、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）属于不同分支。同时将KvSOS1基因构建入植物表达载体pBI121中，并成功转入农杆菌LBA4404中。

关键词：海滨锦葵；耐盐基因；质膜Na+/H+转运蛋白；表达载体

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0076-04

收稿日期：2015-08-14

基金项目：中国农业大学烟台研究院校级项目（编号：YT201204）；国家自然科学基金（编号：41171216）。

作者简介：王红艳（1980—），女，河南安阳人，硕士，助理研究员，主要从事植物逆境生理及分子生物学方面的研究。E-mail：why1980221@163.com。

通信作者：王鸿磊，硕士，副教授，主要从事生化与分子生物学方面的研究。E-mial：whl197749@163.com。盐胁迫是严重影响植物生长发育的主要非生物环境胁迫因素之一。土壤中Na+过高会扰乱植物正常的生理代谢活动，造成植物体内水分亏缺、离子平衡破坏，并引起氧化伤害等次生胁迫，从而导致植物生长受到抑制，甚至死亡[1-2]。植物抵御盐胁迫的有效策略在于降低细胞质中Na+的含量，包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化[3-5]。目前，关于Na+的吸收机制尚不清楚，而Na+的外排和区隔化分别由位于细胞质膜和液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白来调节。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白（SOS1）利用质膜上的P型 H+-ATPase建立的跨膜质子梯度作为驱动力，将胞内过量的Na+运出细胞以消除Na+的毒害，是目前发现的唯一一种介导Na+外排的质膜整合蛋白，在植物抵御盐胁迫过程中发挥着关键作用[6]。

近年来，质膜Na+/H+逆向转运蛋白（SOS1）在植物耐盐性中的作用受到广泛重视，许多植物的SOS1基因已被克隆和鉴定，包括甜土植物拟南芥、水稻、小麦、黄瓜等及盐生植物盐芥、盐地碱蓬、獐茅等[7-13]。这些研究表明，盐胁迫下SOS1能够将Na+从根表皮及皮层细胞中排出胞外，降低Na+的积累。突变体功能互补试验和过表达转基因植株的耐盐生理分析证实，SOS1可以恢复和提高转化体的耐盐能力[14-19]。由此可见，SOS1基因可用于植物耐盐基因工程进行作物遗传改良，是具有重要应用价值的耐盐基因之一。

盐生植物是生存于天然高盐环境的植物群体，在长期的进化过程中形成了有效的盐胁迫应答机制或调控途径，是获得耐盐基因的好材料。因此，从盐生植物中获得SOS1等耐盐基因并深入研究其盐响应调控机制，对进一步了解植物耐盐机制，获得优质耐盐基因意义重大。海滨锦葵（Kosteletzkya virginica L.）是分布于美国含盐沼泽地带的多年生盐生植物，生长基质的含盐量高达2.5%，是一种优良的耐盐经济作物和种质资源[20]。目前对海滨锦葵耐盐性的研究主要集中在盐胁迫对种子萌发和幼苗生长过程的生理特性变化方面，而对其耐盐基因方面的研究很少[21]。本研究利用RT-PCR和RACE技术，克隆海滨锦葵KvSOS1基因，并对其进行生物信息学分析和构建植物表达载体，为该基因的深入研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料海滨锦葵种子，采自中国科学院烟台海岸带研究所山东省东营市试验基地。

1.1.2菌株及质粒载体大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404及表达载体质粒pBI121为笔者实验室保存；基因克隆载体pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 购自TransGen公司。

1.1.3主要试剂RNA提取试剂RNAiso Plus 购自TaKaRa公司；RACE试剂盒购自Clontech公司；限制性内切酶购自Thermo Scientific 公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；PCR mix、DNA Marker、反转录试剂盒、胶回收试剂盒和抗生素购自TransGen公司。引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1海滨锦葵幼苗培养及处理将海滨锦葵种子浸种、催芽后播种在含有干净河沙的营养钵中，1/2 Hoagland营养液浇灌，放入人工气候箱进行常规培养。待海滨锦葵长出4片真叶时，用含有200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液处理24 h，剪取幼苗根部用来提取总RNA。

1.2.2海滨锦葵总RNA的提取及第一链cDNA合成海滨锦葵总RNA的提取按照RNAiso Plus 说明书进行。用超微量分光光度计NanoDrop-2000c检测所提总RNA的浓度和质量。以海滨锦葵总RNA为模板，按照TransGen公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA第一链。

1.2.3海滨锦葵KvSOS1基因全长cDNA的克隆利用GenBank上公布的陆地棉、可可、毛果杨、蓖麻等植物的SOS1基因的同源保守序列，设计1对简并引物DP-F：5′-GG（A/G）GAATCCTT（A/G）ATGAA（C/T）GATGGG AC-3′，DP-R：5′-AC（T/C）A（G/A/T）AGC（G/A）CTTTCCTGCCA（C/T） AG-3′，以海滨锦葵cDNA为模板进行PCR扩增。将PCR扩增得到的目的片断回收纯化后与pEASY-Blunt Zero Cloning Vector连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随机挑取阳性菌落测序。对测序结果进行Blast在线分析，确认为SOS1基因的同源区段后，参照Clontech 公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification 试剂盒的操作方法，分别设计3′-RACE引物和5′-RACE引物，进行海滨锦葵KvSOS1基因3′和5′末端的扩增。将扩增得到的5′-RACE和3′-RACE片段分别进行克隆、测序后，与上述获得的中间片段用DNAMAN软件进行拼接，从而得到海滨锦葵KvSOS1基因的cDNA全长序列。

1.2.4海滨锦葵KvSOS1基因的生物信息学分析对海滨锦葵KvSOS1基因的cDNA全长序列用NCBI的ORF Finder识别开放阅读框并翻译成氨基酸序列；利用ExPAsy服务器上的ProtParam工具 （http：//web.expasy.org/protparam/）分析基因编码蛋白的基本性质；利用在线工具 Conserved Domain Search Service（http：//www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因编码蛋白的功能结构域；利用在线工具TMPRED （http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_ form .html） 进行基因编码蛋白的跨膜预测和疏水性分析；利用在线Blast程序对基因核苷酸序列进行同源性分析，多序列比对分析采用ClustalX 2.1软件；利用 MEGA 4.0 软件中的 Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.2.5海滨锦葵SOS1基因表达载体构建及鉴定根据获得的海滨锦葵KvSOS1基因的cDNA序列及表达载体pBI121上的限制性酶切位点，设计包含完整编码框并含有酶切位点的引物，以海滨锦葵总RNA反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带进行回收纯化后连接pEASY-Blunt Zero Cloning Vector。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。经测序验证后的阳性克隆放大培养并提取质粒，通过双酶切获得带有黏性末端的KvSOS1全长cDNA序列。然后与经过相同双酶切的植物表达载体pBI121采用T4连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆并进行菌液PCR和双酶切验证，最终获得含有重组表达载体pBI121-SOS1的阳性克隆。随后将该阳性克隆放大培养，提取重组质粒，采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404感受态细胞，在含有链霉素和利福平的YEB平板上筛选阳性克隆并进行菌液PCR验证，对菌液PCR鉴定为阳性的克隆即可用于遗传转化。

2结果与分析

2.1海滨锦葵KvSOS1基因全长cDNA序列的获得

使用简并引物DP-F和DP-R进行RT-PCR扩增获得约1 900 bp的cDNA中间片段。将该片段进行回收、克隆并测序，所获得的核酸序列经Blast比对证实该片段与GenBank数据库已知的SOS1基因同源序列具有较高的同源性。根据此片段序列设计特异性引物3′-GSP（5′-GTGCATCCAACTTTTAGTCATGGGAG-3 ′）和5′-GSP（5′-GCTATCC CAAAAGCA ATTCCAACCGC-3′），利用RACE技术获得了海滨锦葵KvSOS1基因的3′末端和5′末端cDNA片段，分别进行回收、克隆、测序得到3′端和5′端片段的长度分别为1 375 bp和809 bp。将上述3个核苷酸序列拼接后，获得了海滨锦葵KvSOS1的全长cDNA序列，其长度为3 850 bp，5′端和3′端分别存在93 bp和313 bp的非翻译区，开放阅读框长度为 3 444 bp。将该基因命名为KvSOS1，GenBank中登录号为KJ577576。

2.2海滨锦葵KvSOS1基因编码蛋白的生物信息学分析

海滨锦葵KvSOS1基因的开放阅读框编码1个由1 147个氨基酸残基组成的蛋白，分子量为127.56 ku，理论等电点pI为6.18。利用NCBI的保守区搜索工具在线分析KvSOS1编码的氨基酸序列，其N-末端具有NhaP、Na+/H+Exchanger、b_cpa1等保守结构域，C-末端有cNMP 、Crp等保守结构域，表明该基因属于Na+/H+转运蛋白家族成员（图1）。用TMPRED软件进行跨膜区预测和疏水性分析表明，该蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11个跨膜区，C-末端为1个长约700个氨基酸残基的亲水性尾巴位于细胞质中（图2）。

同源性Blast比对结果表明，海滨锦葵KvSOS1编码蛋白与多个物种编码SOS1蛋白的氨基酸序列具高度同源性。如表1所示，同源性最高的是雷蒙德氏棉，同源性高达86%，与可可和陆地棉的同源性均为82%，与毛果杨、蓖麻、胡杨的同源性分别为74%、73%、72%。将以上植物的SOS1蛋白与海滨锦葵KvSOS1编码蛋白进行多重序列比对发现，不同植物SOS1的N端跨膜区保守度较高，而C端相对较低。

系统进化树分析显示KvSOS1编码蛋白与其他植物的质膜Na+/H+逆向转运蛋白（SOS1）同属于一个系统发育支，而与液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）亲缘关系较远（图3）。结果表明KvSOS1是编码质膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因。

2.3海滨锦葵KvSOS1基因的植物表达载体构建与鉴定

通过对海滨锦葵KvSOS1基因的序列及表达载体pBI121上的限制性酶切位点分析，利用Primer 5.0、DNA Club等软件设计了包含完整编码框并含有酶切位点的1对引物：KvSOS1-F，5′-TCTAGAATGGAGGAACTGAAGGAGAATC-3′；KvSOS1-R，5′-GTCGACTCAAGAAGCTTGGTTGAATGAT-3′（划线部分TCTAGA为XbaⅠ的酶切位点，GTCGAC为SalⅠ的酶切位点）。利用此对引物以海滨锦葵总RNA反转录后的cDNA为模板扩增KvSOS1基因的编码区（图4）。将目的条带进行回收、纯化、克隆，挑选阳性克隆测序后与之前获得的全长cDNA序列进行比对，确定为目的基因KvSOS1。将该阳性克隆扩大培养并提取质粒，对质粒进行XbaⅠ和SalⅠ双酶切消化处理后，获得带有双酶切位点的目的片段，与经过同样双酶切的植物表达载体pBI121采用T4连接酶进行连接（图5）。

将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆菌液PCR检测表明阳性克隆中含有3.4 kb目的片段（图6），然后将阳性克隆扩大培养并提取重组质粒pBI121-KvSOS1进行Xba Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，结果显示该质粒上含有3.4 kb目的片段（图7）。这表明海滨锦葵KvSOS1基因已成功构建入植物表达载体pBI121中。

2.4重组植物表达载体转化农杆菌LBA4404

采用冻融法将上述构建好的植物表达载体pBI121-SOS1转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，在含有链霉素和利福平的YEB 固体培养基上进行筛选。随机挑取阳性克隆，以基因序列特异引物进行菌液PCR检测，结果显示PCR扩增产物均为 3.4 kb（图8），证明植物重组表达载体 pBI121-SOS1已经成功转入根癌农杆菌LBA4404中，此农杆菌可用于下一步的遗传转化。

3讨论

在植物抵御盐胁迫的过程中，质膜Na+/H+逆向转运蛋白不仅参与植物根部的Na+外排，在维持细胞K+的稳态平衡、调节细胞内pH值和Ca2+转运以及植物体内Na+的长距离运输中也起着重要作用，对其进行深入系统地研究意义重大[22-23]。目前，对盐胁迫条件下拟南芥中的SOS（Salt Overly Sensitive）信号通路研究得比较清楚[24-25]，在水稻和盐芥中也发现了相似的SOS途径[26]。在SOS途径中，SOS1需经SOS2/SOS3蛋白激酶复合体磷酸化而激活其离子转运活性，它是至今发现的唯一能把Na+从细胞内运输到细胞外的膜运输蛋白，与植物耐盐性关系密切。大量研究证实，盐胁迫可激活SOS1并诱导其基因上调表达，例如拟南芥、水稻、小麦、星星草、胡杨的SOS1基因均可被盐胁迫诱导，上调它们的表达量。过量表达拟南芥、水稻、胡杨等的SOS1基因可提高转化植物的耐盐能力[15-19]。目前，已报道的不同植物中SOS1的结构同源性非常高，特别是N-末端的10～12个跨膜结构域非常相似，而C-末端的差异相对较大，这可能是不同植物中SOS1离子转运活性响应逆境胁迫的差异所在。Takahashi等发现来源于耐盐基因型芦苇SOS1比盐敏感基因型芦苇SOS1能够更有效地将Na+排出细胞，更大程度地提高转基因酵母的耐盐能力[27]。因此，从盐生植物中发掘SOS1基因并对其进行深入研究对于获得优良耐盐基因资源和耐盐基因工程具有重要的应用价值。海滨锦葵是一种具有多种经济价值的盐生植物，在长期适应环境的过程中，可能进化出独特的离子调控机制，从中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白等耐盐基因并深入研究其结构功能，对发挥其在盐土农业及耐盐工程育种等方面的作用具有重要意义。

4结论

本研究利用RT-PCR和RACE技术从海滨锦葵中首次克隆出该植物质膜Na+/H+转运蛋白基因的全长cDNA序列，命名为KvSOS1，GenBank登录号为KJ577576，全长为 3 850 bp，开放阅读框长度为3 444 bp。生物信息学分析表明该基因属于质膜Na+/H+转运蛋白基因家族。同时，已将海滨锦葵KvSOS1基因构建入植物转基因表达载体pBI121中，并成功转入农杆菌LBA4404中。这为后续研究中将该基因转化模式植物拟南芥以研究其功能以及耐盐基因工程育种等方面奠定了重要的基础。

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