厌氧氨氧化功能微生物PCR—DGGE分析方法优化

毕玮++李祥++刘恒蔚++黄勇++袁怡++刘忻

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.026

摘要：基于厌氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）开发的相关工艺在污水脱氮处理中具有重要作用；但Anammox微生物是一类目前尚不能分离和纯培养的微生物，分析其功能微生物的类型，对于研究其生物学机理并改良其工艺具有重要意义。本研究对变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）在Anammox微生物应用中的分析条件进行了优化，以提高PCR-DGGE的分析效果。结果表明，采用针对16S rDNA V3区的 GC-F341/R518引物组合，PCR最佳退火温度为64 ℃；DGGE电泳中，最佳上样量为5～7 μL，最佳胶浓度为8%，最佳电压/时间为80 V/16 h。优化后的PCR-DGGE具有准确性高和灵敏度好的特点。

关键词：厌氧氨氧化；PCR-DGGE；微生物类型；条件优化

中图分类号： S188文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0110-03

收稿日期：2015-09-30

基金项目：国家自然科学基金（编号：51478284）；国家自然科学基金青年科学基金（编号：51408387）。

作者简介：毕玮（1990—），男，硕士研究生，主要从事环境生物催化机理研究。E-mail：1012296010@qq.com。

通信作者：刘恒蔚，博士，副教授。E-mail：liuhw@mail.usts.edu.cn。厌氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）是指厌氧氨氧化细菌在厌氧条件下以羟胺和肼为中间产物，以NH+4 为电子供体、NO2-为电子受体，将NH+4 和NO-2 转变为N2 的过程[1]。该反应颠覆了人们对自然界氮素循环的传统认识。此前普遍认为通过异养反硝化即硝酸盐还原生成N2，是地表氮素生成N2的唯一自然途径，而目前却发现Anammox反应的广泛存在。据估计由AAOB完成了海洋生态系统氮转化的30%～50%[2]。Anammox过程在地表氮素循环，包括农业水体氮素循环中起着重要作用。基于Anammox过程研究者开发了多种污水处理工艺[3-6]。与传统的硝化-反硝化工艺相比，优点在于不需要额外电子供体，同时也可使剩余污泥产量降至最低，从而节省大量污泥处置费用。厌氧氨氧化细菌（即Anammox菌）是一类不可培养的微生物类型，难以使用传统手段进行研究。目前共发现了包括Candidates Kuenen stuttgartiensis、Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Anammoxoglobus sulfate在内的5个属12个种之多，而且不同的研究得到的优势种群不同[7]。分析其功能微生物的类型，对于研究其生物学机理并改良其工艺具有重要意义。

PCR结合变性梯度凝胶电泳（deatring gradient gel electrophoresis，DGGE）技术不但克服了传统的微生物培养方法的局限性，而且可以对微生物种群进行定性和定量，以及预测微生物种群的系统发育关系，成为研究环境微生物多样性的常用手段之一。其主要原理是序列不同的DNA双链解链所需的变性剂（尿素和甲酰胺）浓度也不同，在含梯度变性剂的凝胶电泳中，不同的DNA序列在不同的浓度处发生解链，导致空间构型改变，电泳速率急剧下降，从而停留在不同的位置，形成条带分开的指纹图谱。为了提高DGGE的分辨率，可在引物的一端加上1个含30～50个碱基的“GC夹板”（GC clamp）[8]。理论上，DGGE可以检测出只有1个碱基差异的DNA序列。但是DGGE效果受多种因素影响，特别是对于不同的引物和不同的样品，PCR-DGGE分析的参数差别很大。例如使用不同引物在对厌氧污泥样本PCR-DGGE分析中[5-6，9-15]，聚丙烯酰胺凝胶浓度从5%～10%、电泳电压从75～200 V均有使用。DGGE的分辨率直接影响结果的准确性和可靠性，而分辨率又会受到电泳中的变性剂梯度范围、时间、电压以及上样量等因素影响；因此针对具体的样品类型和引物，需对DGGE试验各个关键参数进行优化，才能达到预期的效果。16S rDNA是细菌系统分类研究中最常用的分子指纹，分子大小适中，在结构与功能上具有高度的保守性。基于16S rDNA的V3区是微生物种群分析最常采用的目标序列之一，在分子生态研究中有广泛的应用。

本研究基于Anammox微生物16S rDNA的V3区的 GC-F341/R518引物组合，对PCR的退火温度和DGGE的时间/电压、胶的浓度以及上样量进行了优化，该结果对于 Anammox 反应相关微生物的分析具有参考意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料样品来自苏州科技学院环境生物技术研究所亚硝酸盐型Anammox污泥。

1.1.2主要仪器与试剂DNA快速提取试剂盒购自MPBIO公司；NanoDrop2000仪；ExTaq酶购自TaKaRa公司；DGGE电泳仪（AD0412LS-C50）、DGGE电泳槽（DCode型）、凝胶成像系统（Gel DocTM XR+）购自美国伯乐公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1核酸提取与PCR-DGGE分析污泥取样后立即使用液氮研磨成干粉，-80 ℃保存备用。使用DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取的DNA经1%琼脂糖电泳检测和NanoDrop2000仪定量并检测质量后使用。使用针对细菌16S rRNA基因V3可变区通用引物进行PCR，引物序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTA

CGGGAGGCAGCAG（即GC-F341）；ATTACCGCGGCTGCTGG（即R518）。

PCR扩增体系总体积为30 μL，包括15 ng模板DNA，ExTaq酶1.5 U，10 μmol/L引物各1.5 μL，dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）3 μL，ExTaq酶buffer 3 μL，ddH2O补足至 30 μL。PCR扩增采用98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，根据设置的温度退火30 s，72 ℃延伸5 s，共29个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖电泳检测后，按不同上样量均加入15 μL上样缓冲液，并使用ddH2O补足至25 μL，利用DGGE电泳仪和DGGE电泳槽在变性梯度为45%～65%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳（100%的变性剂浓度为体积分数40% 甲酰胺和7 mol/L 尿素）。参考乐晓萍等的银染方法[16]进行染色。银染时凝胶在固定液（含体积分数10%乙醇和0.5%的乙酸）轻摇固定10 min，超纯水漂洗1 min后放入染色液（含体积分数2%硝酸银）中染色15 min，超纯水快速冲洗2次后放入显影液（含体积分数1.5%氢氧化钠、体积分数02%甲醛）中至显影清晰，用超纯水冲去残余的显影液。银染结果通过凝胶成像系统照相分析。

1.2.2PCR-DGGE优化（1）PCR退火温度的优化：退火温度从61～66 ℃之间设置6个梯度，梯度为1 ℃，PCR产物通过2.0%琼脂糖电泳，选择最合适的退火温度用于PCR-DGGE分析以及后续优化过程。（2）电泳时间和电压的优化：制备8%聚丙烯酰胺凝胶，设置60、80、100、120 V共4个电压梯度；每隔2 h上样1次，共上样5次，即各设置5个时间梯度；上样量为4.0 μL。在60 ℃条件下对不同电压下分别进行不同时间进程的电泳试验，以确定最佳的电压/时间组合。（3）电泳上样量的优化：配制总体积相同、但PCR扩增产物不同的上样体系，上样量（PCR扩增产物）为1～10 μL，梯度1 μL。使用最适变性剂梯度和已确定的最佳电压/时间条件，在8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。（4）凝胶浓度优化：使用上述已确定的上样量、最佳电泳时间和电压组合，分别配制浓度为6%、8%和10%的聚丙烯酰胺凝胶，根据电泳效果来确定最适合的胶浓度。

2结果与分析

2.1土壤基因组DNA的提取

提取的Anammox样品DNA经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，结果（图1）表明，DNA样品质量较好，适合进行PCR-DGGE分析。

2.2PCR扩增的退火温度优化

图2是61～66 ℃不同退火温度下的PCR电泳结果。图2表明，退火温度为64 ℃时，扩增效率高，效果最好，是本研究的最佳退火温度。电泳结果显示PCR产物大小与预计结果（230 bp）基本一致。

2.3电泳时间和电压的优化

本试验在预试中使用了200 V电压进行DGGE电泳，结果发现，该电压下条带有弥散严重，分离效果较差，因此选择在低电压区进行优化。通过比较120 V（图3-A）、100 V（图3-B）、80 V（图3-C）和60 V（图3-D）的电泳结果说明，电压高低对条带的分离效果影响较为明显，随着电压降低，弥散减弱，且条带数增加，条带更为清晰锐利。在80 V（图3-C）和60 V（图3-D）之间差异不大，均能得到数目较多且清晰锐利的条带。随着电泳时间延长，条带分离更加明显，易于区分，在80 V电压时，多数条带在16 h时分离效果最好，延长电泳时间变化不明显，与60 V的电压时18 h的电泳效果基本一致。鉴于此，选择80 V/16 h作为最佳的电压/时间组合。

2.4电泳上样量的优化

从图4可以看出上样量对DGGE图谱也有着重要的影响。上样量过少，部分条带不清晰，染色后可见的条带数偏少；上样量过多，则图谱的背景过重，不利于后续的分析。考虑到二者的平衡，在Anammox微生物的PCR-DGGE分析中选择5～7 μL的上样量效果最好。

2.5凝胶浓度优化

本试验通过3种不同浓度的凝胶[分别是6%（图5-A）、8%（图5-B）、10%（图5-C）]来判断最佳的凝胶浓度。从图5的3个浓度对比可以看出，8%凝胶的分离度最好，条带清晰锐利，为最佳凝胶浓度选择。

3讨论

DGGE技术被广泛用于分析环境样本微生物群落的生物多样性，适合调查种群的时空变化，并可以通过对目的条带进行序列分析来鉴定群落组成。理想的PCR引物和DGGE分析条件应适合探测更多的微生物类型。例如王宁等对厌氧颗粒污泥PCR-DGGE分析进行优化，发现古菌和细菌在80 V/10 h的电泳条件下均能得到分离效果较好的DGGE 图谱[17]。而本研究结果说明对于Anammox活性污泥，采用GC-F341/R518通用引物，PCR最佳退火温度为64 ℃；变性剂浓度为45%～65%的聚丙烯酰胺凝胶中进行DGGE电泳的最佳上样量为5～7 μL，胶浓度为8%，最佳电压/时间为80 V/16 h。由于本研究采用针对16S rDNA的V3区的特异引物，对于环境样本的不同微生物种类将具有更广泛的适用性。

PCR和电泳是PCR-DGGE分析的2个最关键环节，本试验研究表明适当提高退火温度有利于减少非特异性扩增，上样量的多少与胶浓度的大小也对DGGE的分辨率有重要影响。此外，与一般的PCR对模板DNA要求低不同，本研究中还发现DNA质量对PCR影响较大，且PCR扩增质量显著影响DGGE的分辨率。

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