水稻叶色突变体812HS蛋白质复合物和叶绿素合成特性的研究

蒋苑++刘莉++吕春芳++陈国祥+++高志萍+++吕川根

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.031

摘要：以水稻叶色突变体812HS与野生型812S为材料，利用蓝绿温和胶电泳技术和生理方法对叶尖端类囊体膜蛋白质复合物含量以及叶绿素合成前体物质进行了比较。结果表明，和野生型812S相比，水稻叶色突变体812HS在分蘖盛期叶绿素含量开始明显减少，叶绿素a/叶绿素b比值增加，突变体的类囊体膜蛋白质复合物如光系统Ⅱ捕光色素蛋白（LHCⅡ）含量、光系统Ⅰ核心复合体（PSⅠcore）含量和F1-ATP合酶复合体和细胞色素b6/f复合体（F1-ATPase&Cy tb6/f）含量显著减少。突变体812HS叶片叶绿素合成代谢中间产物5-氨基酮戊酸（ALA）、胆色素原（PBG）、尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）含量均显著高于野生型812S，而原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、镁原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）、原脱植基叶绿素（Pchlide）、Chla、Chlb含量却显著低于野生型812S。即水稻叶色突变体812HS的叶绿素含量明显减少，一方面是由于囊体膜蛋白质复合物的减少影响了其对光的吸收和传递；另一方面通过测定叶绿素合成的前体物质初步认为是由于叶绿素合成过程中UrogenⅢ到ProtoⅨ合成过程受阻所致。

关键词：水稻叶色突变体812HS；类囊体膜蛋白质复合物；叶绿素前体合成物质；水稻

中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0127-05

收稿日期：2015-10-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：31271621）；江苏省普通高校自然科学研究计划（编号：14KJB180011）；江苏高校优势学科建设工程（编号：PAPD）；江苏省自然科学青年基金（编号：BK20140916）；江苏省现代作物生产协同创新中心资助。

作者简介：蒋苑（1992—），女，江苏徐州人，硕士研究生，主要从事植物光合生理生化研究。E-mail：jiangyuan_2016@163.com。

通信作者：高志萍，女，博士，讲师，主要从事植物光合生理生化研究。E-mail：ketty.gao@gmail.com 。绿色植物吸收光能同化二氧化碳和水，制造有机物质并释放氧气的过程称为光合作用。植物通过光合作用将光能转变为化学能储藏在有机物中，叶绿素作为光合作用的重要色素，它的功能不仅是构成光系统及光系统反应中心[1]，吸收大量光能[2]，也是大多数植物叶片呈现绿色的主要原因，因此它对植物的生长及农作物产量具有极其重要的作用。正常叶色是植物长期进化的结果，而叶色突变也是植物界中发生频率相对较高的一种突变类型，在20世纪初就已经有关于叶色突变体的报道[3]。目前已经在多个植物中获得了叶色突变体，如水稻[4]、小麦[5]、烟草[6]、玉米[7]等。叶色突变体有着极为重要的作用，在育种工作中，叶绿素突变体既可以作为标记性状进行杂交生产[8]，又可以作为特殊的优良性状提供资源[9]，在基础研究工作中，叶色突变体是研究植物光形态建成[10]、植物激素生理[11]、光合作用[12]等研究的理想材料。

水稻叶色突变类型是叶色突变体中比较丰富的一种，主要特征是其叶色表型发生了变异，表现为不正常的绿色，如白化、黄化、黄叶尖、斑马叶等。其产生方法除了自发突变外，其他突变来源主要为物理化学诱变[13]、T-DNA插入突变[14]和转座子插入突变[15]。水稻叶色突变类体的突变基因遍及水稻整个基因组中，据不完全统计，已定位的叶色突变基因有70多个[16]。随着分子生物学的快速发展，对于水稻叶色突变相关基因的克隆也逐渐成为国内外研究的热点，如编码高等植物的叶绿素合成途径中酶的基因已经被全部克隆[17]。

本研究所用的水稻叶色突变体812HS是籼稻两用不育系水稻812S的一个自然突变体，该突变体812HS在秧苗期叶片正常绿色，分蘖盛期—拔节期，特别是梅雨期过后，叶片尖端出现非常明显的发黄现象，但是下面的叶子表现为正常的绿色，之后812HS新出的叶片尖端发黄现象减弱，比正常水稻叶片颜色稍淡，但之前发黄的叶片尖端不再恢复绿色，这种现象不同于以往的叶片早衰现象。但是它也导致叶片的光合效率下降，进而影响水稻光合生产和产量形成。因此本研究以水稻叶色突变体812HS与野生型812S为材料，对其类囊体膜蛋白质复合物和叶绿素合成代谢中间产物进行比较研究，揭示此突变体叶片尖端变化的机理及其对光系统色素蛋白的影响，为进一步深入探索叶色变异的生化和分子调控机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

水稻叶色突变体812HS和野生型812S由江苏省农业科学院粮食作物研究所提供，5月初播种，6月上旬栽插，按照水稻常规的种植方法进行管理。待剑叶全展后，每隔10 d左右采集功能叶，只采发黄的尖端叶片，采样从2014年7月14日开始，到8月24日结束，共采样5次，每次测定重复3次。

1.2试验方法

1.2.1叶绿素含量的测定光合色素含量测定参照Arnon的方法[18]稍作修改，称取去脉的新鲜水稻尖端叶片 0.1 g，加入80%的丙酮和少许石英砂提取，离心2次后定容至10 mL，利用Thermo GENESYS 10UV紫外-可见分光光度计测定其在D663 nm、D645 nm处的吸光度，用于计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。

1.2.2蓝绿温和胶电泳

1.2.2.1类囊体膜蛋白的制备取去除中脉的水稻剑叶剪碎，加入适量预冷的提取缓冲液（400 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6，10 mmol/L NaCl），用高速组织捣碎机进行5次3 s捣碎，4层纱布过滤，200 g离心3 min去除细胞碎片；取上清6 000 g离心10 min，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L Tris-HCl、pH 值7.6、10 mmol/L NaCl溶液中5 min以去除蔗糖；6 000 g离心10 min，弃上清，沉淀加入适量样品缓冲液（25 mmol/L BisTris-HCl，20% Glycerol，pH 值7.0）悬浮，6 000 g离心10 min，得到的沉淀加入少量样品缓冲液悬浮（25 mmol/L BisTris-HCl，20% Glycerol，pH 值 7.0）即得到类囊体膜蛋白溶液。用Bradford法测定蛋白浓度，然后分装进行处理或者-80 ℃保存备用。

1.2.2.2样品增溶类囊体膜蛋白溶液缓慢滴加等体积质量浓度为3%的DM，充分混匀黑暗下冰上增溶30 min，16 000 g 离心20 min去除不溶物质，取上清加入1/10体积的溶液（5% 考马斯亮蓝G-250，100 mmol/L BisTris-HCl，pH值 7.0，30%蔗糖，500 mmol/L 6-aminon-caproicacid）后混匀，上样进行电泳。

1.2.2.3温和电泳采用北京六一生物科技有限公司DYCZ-23A型电泳槽，配制厚度1.0 mm凝胶，5%～13%梯度的分离胶和4%的浓缩胶，凝胶中含有50 mmol/L BisTris，pH 值7.0，500 mmol/L 6-aminon-caproicacid，4 ℃保存过夜，第2天进行电泳。电泳开始时电极缓冲液为含0.01%考马斯亮蓝G-250、50 mmol/L Tricine、15 mmol/L BisTris的阴极缓冲液和含 50 mmol/L BisTris-HCl、pH 值7.0的阳极缓冲液。在4 ℃条件下，当前端考马斯亮蓝G-250走至分离胶的1/2处时，阴极端换为不含考马斯亮蓝的阴极缓冲液。

1.2.3叶绿素前体物质的测定

1.2.3.15-氨基酮戊酸（ALA）的测定参照Dei的方法[19]略有改动，称取0.5 g尖端叶片，在液氮中研磨，加入质量浓度为4%的三氯乙酸，定容至20 mL，18 000 g离心 15 min，取5 mL上清液加入2.35 mL乙酸钠（1 mol/L）和015 mL乙酰丙酮，沸水10 min后冷却至室温。取其中的 2 mL 加入2 mL显色液（Ehrlich-Hg试剂），黑暗下15 min后，测D553 nm值，ALA含量以D553 nm的摩尔消光系数7.2×104 L/（mol·cm）计算。

1.2.3.2胆色素原（PBG）的测定参考Bogorad的方法[20]提取，取0.5 g尖端叶片用液氮研磨后，加入5 mL提取缓冲液（0.6 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，pH值 8.2），18 000 g离心10 min。取2 mL加入2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗中显色15 min，测D553 nm，PBG含量以D553 nm的摩尔消光系数6.1×104 L/（mol·cm）计算。

1.2.3.3尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）测定参考Bogorad的方法[20]提取，取0.5 g尖端叶片用液氮研磨后，加入10 mL提取缓冲液，过滤或18 000 g离心10 min。取5 mL加入0.25 mL 1%的Na2S2O3溶液，再用强光照射20 min。加入1 mol/L甲酸（或乙酸）至pH值3.5。用10 mL乙醚萃取3次，分层后测水相的D405.5 nm，得Urogen Ⅲ。Urogen Ⅲ含量以D405.5 nm的摩尔消光系数5.48×105 L/（mol·cm）计算。

1.2.3.4原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、镁原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）、原脱植基叶绿素（Pchlide）的测定采用Hodgins等的方法[21]略有改动，取0.5 g去叶脉鲜叶，加25 mL 80%碱性丙酮，研磨提取后，分别在波长D575 nm、D590 nm和D628 nm处测得吸光度，并以下列公式计算其含量。

ProtoⅨ含量=0.180 16×D575 nm-0.040 36×D628 nm-0.045 15×D590 nm；

Mg-ProtoⅨ含量=0.060 77×D590 nm-0.019 37×D575 nm -0003 423×D628 nm；

Pchlide含量=0.035 63×D628 nm+0.007 225×D590 nm-0003 423×D628 nm。

2结果与分析

2.1叶色表型及叶绿素含量的变化

和野生型812S相比，水稻突变体812HS剑叶的尖端从7月24日（水稻分蘖盛期）开始出现显著的尖端发黄现象（图1），并且在后期发黄现象更加明显。由图2叶绿素含量可以看出，在7月14日突变体812HS和野生型812S总叶绿素含量相差不大，而到7月24日，突变体812HS叶绿素含量比野生型少26.2%，差异显著（P<0.05），以后各个时期突变体812HS叶绿素含量比野生型分别低35.4%、36.8%、27.9%，这和突变体的叶色表型相符。而图2的叶绿素a/叶绿素b比值显示在7月14日和7月24日期间，突变型812HS叶片叶绿素a/叶绿素b比值与野生型无显著差异，8月4日、8月14日和8月24日，突变型812HS叶片叶绿素a/叶绿素b比值比野生型分别高26.9%、26.2%、31.6%，差异显著 （P<0.05），这表明在突变体812HS中叶绿素b的降解速度较叶绿素a降解更快。

2.2蓝绿温和胶电泳分析突变体蛋白质复合物的变化

利用蓝绿温和胶电泳技术，分别选取了7月14日、8月4日和8月24日的叶片尖端进行电泳，并对不同时期突变体812HS和野生型812S的叶绿体类囊体膜蛋白复合物各亚基变化进行了分析。结果从突变体812HS和野生型812S的叶绿体类囊体膜中分离出7条类囊体膜蛋白复合体带。利用 Bio-Rad Quantity One V4.6.2对图像预测分子量，参考Shao等的研究[22]鉴别各复合物条带，分别为超级复合物（Supercomplexes）、光系统Ⅰ与捕光复合物Ⅰ（PSI core+LHC Ⅰ）、光系统Ⅰ核心复合体（PSⅠ core）、F1-ATP合酶复合体

&细胞色素b6/f复合体（F1-ATPase & Cytb6/f）、光系统Ⅱ核心（PSⅡ core）、三聚体捕光复合物Ⅱ（Trimeric LHC Ⅱ）、单体捕光复合物Ⅱ（Monomeric LHC Ⅱ）（图3）。

将突变体812HS与野生型812S类囊体膜蛋白质复合物含量经过Bio-Rad Quantity One V4.6.2软件分析条带的光密度，以野生型812S水稻各时期的蛋白质复合物含量为100%，换算出突变体812HS中各蛋白质复合物含量的百分数（图4）。结果显示和野生型812S相比，在7月14日突变体812HS含量下降显著的是光系统Ⅰ核心复合体（PSⅠ core）、F1-ATP合酶复合体&细胞色素b6/f复合体（F1-ATPase & Cytb6/f）、三聚体捕光复合物Ⅱ（Trimeric LHCⅡ）和单体捕光复合物Ⅱ（Monomeric LHCⅡ），分别为野生型的 74.7%、70.5%、75.3%和69.5%。8月4日突变体812HS含量下降的显著仍然是这4个，分别是野生型的73.9%、657%、72.6%、和75.7%。而8月24日，突变体812HS含量下降显著的是F1-ATP合酶复合体&细胞色素b6/f复合体（F1-ATPase & Cytb6/f），是野生型的64.5%。

2.3水稻叶色突变体812HS与野生型812S叶片叶绿素合成代谢中间产物含量比较

为进一步探讨突变体812HS叶片尖端叶绿素含量减少的生理原因，对尖端叶片的叶绿素前体物质ALA、PBG、UrogenⅢ、Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ和Pchlide的相对含量进行了测定（设野生型812S各物质的含量为100%，突变体812HS中各物质的含量换算成野生型各物质的百分数），结果见图5。根据结果显示，在各时期突变体812HS叶片叶绿素合成代谢中间产物ALA、PBG、Urogen Ⅲ含量均显著高于野生型，而中间产物ProtoⅨ、Mg-Proto Ⅸ、Pchlide、Chla、Chlb含量却显著低于其野生型。这表明突变体812HS叶绿素的生物合成可能在UrogenⅢ到ProtoⅨ合成过程受到了阻抑，叶绿素生物合成代谢受阻导致了突变体812HS叶片的叶绿素含量减少。

3讨论

叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素，含量的高低直接影响植物的光合速率[23]。叶绿素在植物体内都不是单独存在，都是以叶绿素-蛋白质复合物结合于类囊体膜上，是进行光合作用的光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的重要组成部分。其中叶绿素a主要存在于光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的核心复合体中，而叶绿素b是构成捕光天线复合体的重要组成部分[24]。当叶绿素缺乏时，会影响到各种色素蛋白复合物的结构[25]，同时也会导致光系统受到破坏、电子传递效率降低[26]。本试验中突变体812HS的叶绿素含量在7月24日以后开始大幅减少，导致了突变体对于光能的吸收和传递能力下降从而降低了光合效率。叶绿素a/叶绿素b的结果表明突变体812HS叶绿素b在生育期更快速减少，可以推测在光合膜相关色素蛋白复合物中，捕光天线降解较多，在后来的分离类囊体膜蛋白复合物试验中验证了这种猜想。

试验利用温和蓝绿胶技术提取类囊体膜蛋白复合物，该技术能在不破坏蛋白质复合物结构的前提下，将蛋白质复合物以近似天然的状态分开[27]，同时在试验技术方面进行了一定的改良，一方面大大减少了水稻蛋白提取时间，同时采用小胶板配胶提高了效率。最终试验成功分离到了7条带，并将突变体812HS和野生型812S尖端叶片的类囊体膜蛋白复合物和叶绿素含量进行比较。发现在7月14日和8月4日，随着叶绿素含量的减少，突变体蛋白复合物尤其是光系统Ⅰ核心复合体，F1-ATP合酶复合体&细胞色素b6/f复合体，三聚体捕光复合物Ⅱ和单体捕光复合物Ⅱ下降较为明显。

光系统Ⅱ主要是由反应中心、捕光复合体Ⅱ和放氧复合体等亚单位组成，分布在类囊体基粒片层的垛叠区[28]。捕光复合体Ⅱ结合了类囊体膜上50%的色素，天然生理状态主要以三聚体存在，离体后会出现解聚[29]，主要功能是捕获和传递光能，将产生的电子传递给脱镁叶绿酸，最终还原质醌[30]。突变体812HS的三聚体捕光复合物Ⅱ和单体捕光复合物Ⅱ都有不同程度的降解，这必然会影响叶片对光能的转化效率。光系统Ⅰ核心复合体是组成光系统Ⅰ的重要部分，光系统Ⅰ催化光形成电子从质体蓝素经过一系列电子传递体给铁氧还蛋白Fd[31]。突变体光系统Ⅰ核心复合体的降解影响了叶片的光系统Ⅰ功能。F1-ATP合酶复合体对于叶绿体光能转化和光系统Ⅱ有着密切关联[32]，而细胞色素b6/f复合体是光能电子传递的重要蛋白复合体[33]。总之，这些类囊体膜蛋白复合物含量的减少意味着突变体的光合效率大大减少。陈熙等对水稻低叶绿素b突变体ZH249-Y的类囊体膜进行研究发现，突变体LHCⅠ的比野生型有显著下降，同时突变体LHCⅡ各组分较野生型均有下降[34]。李光荣等对水稻高叶绿素突变体的类囊体膜蛋白质复合物进行研究发现，突变体LHCⅡ三聚体和LHCⅡ单体都明显高度表达，具有更高水平的LHC蛋白[35]。

在高等植物叶绿素的合成依下列途径进行：Glu→ALA→PBG→UrogenⅢ→ProtoⅨ→Mg-protoⅨ→Pchlide→叶绿素a→叶绿素b[36]，这是一系列酶学催化过程，任何一个合成步骤受阻，受阻以前的物质会积累，受阻步骤以后的物质会减少，从而改变了叶绿体中各种色素的比例，引起了叶色的改变，不同的突变体阻碍的步骤不同。徐培洲等以叶绿素缺乏突变体水稻为材料研究其叶绿素的合成特性，发现突变体叶绿素缺乏的原因是原脱植基叶绿素到脱植基叶绿素的合成受阻所致[37]。本研究通过测定叶绿素合成前体物质，发现突变体812HS的ALA、PBG、UrogenⅢ含量明显积累，而中间产物ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ、Pchlide、叶绿素a、叶绿素b含量却显著低于其野生型，因此初步认定是UrogenⅢ到ProtoⅨ合成过程受阻导致叶绿素不能正常合成。叶绿素的降低导致类囊体膜蛋白复合物不能正常形成，而类囊体膜蛋白复合物的减少反过来又影响了叶片光系统Ⅰ和光系统Ⅱ对于光的捕获和吸收。本研究结果表明，突变体812HS叶绿素含量的降低是由于粪卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）到原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）的合成受阻，并导致了类囊体膜蛋白复合物的降解，这将为进一步深入探索突变体812HS叶色变异的生化和分子调控机制提供理论基础。

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