N—苄氧羰基—氨基酸—霉灵的合成及杀菌活性

陈然++方祖凯++李黎++胡奎++牛俊凡++李俊凯

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.048

摘要：为合成N-苄氧羰基（Cbz）-氨基酸-霉灵，并测定新化合物的室内杀菌活性。采用N，N′-环己基碳二亚胺（DCC）和[4-（N，N-二甲氨基）吡啶]（DMAP）形成的脱水缩合体系，N-苄氧羰基氨基酸和霉灵发生缩合反应生成13个新化合物。采用菌丝生长速率法测定各化合物对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）的杀菌活性。N-苄氧羰基-丙氨酸-霉灵、N-苄氧羰基-脯氨酸-霉灵、N-苄氧羰基-苯丙氨酸-霉灵、N-苄氧羰基-甲硫氨酸-霉灵对小麦赤霉病菌的抑制中浓度（EC50）分别为0.264、0.212、0.225、0.205 mmol/L，低于对照药剂霉灵的抑制中浓度（0.338 mmol/L）；N-苄氧羰基-脯氨酸-霉灵、N-苄氧羰基-苯丙氨酸-霉灵、N-苄氧羰基-甲硫氨酸-霉灵对棉花枯萎病菌的抑制中浓度分别为0.234、0.277、0.289 mmol/L，低于对照药剂霉灵的抑制中浓度（0.479 mmol/L）。合成的衍生物均保持了霉灵的生物活性，具有杂环、苯环或杂原子的氨基酸结构能够增加衍生物的活性。

关键词：N-苄氧羰基-氨基酸-霉灵；合成；杀菌活性；小麦赤霉病；棉花枯萎病

中图分类号： S482.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0185-04

收稿日期：2015-09-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：30971948；31371976）。

作者简介：陈然（1990―），男，湖北洪湖人，硕士。E-mail：changdachenran@163.com。

通信作者：李俊凯，博士，教授，主要从事新农药开发与农药环境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com。霉灵（hymexazol）是一种内吸性杀菌剂和植物生长调节剂[1]，主要用作拌种、拌土或随水灌溉。霉灵在植物体内经代谢可产生2种糖苷，被植物吸收后可提高作物的生理活性，如促进植株生长、根分蘖、根毛增加、提高根的活性。在土壤中，霉灵可降解成毒性很低、对土壤中的微生物生态无影响、对环境安全的化合物[2-4]。

氨基酸类农药可以作为除草剂[5]、杀虫剂[6]、杀菌剂[7]和植物生长调节剂[8]。由于氨基酸类农药化学结构选用了自然界本身存在的氨基酸结构，并且自然界存在着相应的可分解它们的微生物群，因此这类农药容易被分解而不易造成残留污染[9]，而且降解后的氨基酸还能作为植物生长营养剂，对农作物有较好的增产效果[10]。氨基酸酯类农药是氨基酸类农药之一。Boesenberg等报道了一些分子结构中含卤代芳环且具有除草活性的氨基酸酯类衍生物，如N-酰基氨基酸酯、苯并唑基氨基酸酯、苯并噻唑基氨基酸酯等[11]。Chen等合成了一系列含氮芥、磷、硫及苯环的氨基酸酯类衍生物，发现其具有良好的除草和杀菌活性[12]。

研究表明，将活性农药分子与氨基酸进行耦合，不仅可以得到具有一定活性的新化合物，而且还可以大大改善农药的传导性[13]。基于氨基酸类农药的优点以及霉灵的结构特点，笔者将霉灵和不同种类的氨基酸进行拼接，合成一系列未见文献报道的N-苄氧羰基-氨基酸-霉灵，以期为提高霉灵的杀菌活性，并扩大霉灵的杀菌谱提供理论指导。化合物合成路线见图1。

1材料与方法

1.1供试材料

小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）；棉花枯萎病菌（F. oxysporum），均由长江大学农学院病理研究室提供。

97%霉灵原药，淄博德樽贸易有限公司；95%氯甲酸苄酯（Cbz-Cl）、N，N′-环己基碳二亚胺、4-（N，N-二甲氨基）吡啶等试剂为市售分析纯；L-甘氨酸（Gly）、L-丙氨酸（Ala）、L-缬氨酸（Val）、L-亮氨酸（Leu）、L-异亮氨酸（Ile）、L-脯氨酸（Pro）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-色氨酸（Trp）、L-甲硫氨酸（Met）、L-苏氨酸（Thr）、L-丝氨酸（Ser）、L-酪氨酸（Tyr）、L-组氨酸（His）等氨基酸为市售生化试剂。

LABOROTA4003型旋转蒸发仪（德国）、Bruker600型核磁共振仪（德国）、WRR熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司）、EA3000元素分析仪（意大利利曼有限公司）、ZF-2型三用紫外分析仪（上海市安亭电子仪器厂）、85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）、SPX-80-Ⅱ型生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2化合物的合成

1.2.1N-Cbz-氨基酸的合成通法[14] 称取0.05 mol氨基酸和0.05 mol（5.3 g）无水碳酸钠于250 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水溶解。冷却至-5 ℃，缓慢滴入0.06 mol（10235 g）氯甲酸苄酯，滴加完毕后缓慢升温至室温，反应 5 h。反应体系用乙醚洗涤（60 mL），弃乙醚层；水相用 6 mol/L 的盐酸调pH值至1，然后用乙酸乙酯萃取（90 mL），饱和氯化钠水溶液洗涤（40 mL）有机相至中性，加入无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。用乙醚 ∶甲苯（1 ∶1）溶解粗品，石油醚重结晶得目标产物Ⅰa-m。

1.2.2N-Cbz-氨基酸-霉灵的合成通法参考文献[15-17]方法。称取0.03 mol N-苄氧羰基-氨基酸（Ⅰ）于150 mL圆底烧瓶中，加入50 mL乙腈，待完全溶解后，分别加入0035 mol（3.470 g）霉灵和0.35 g 4-（N，N-二甲氨基）吡啶，充分溶解后冷却至-5 ℃。称取0.035 mol（7.222 g）N，N′-环己基碳二亚胺于烧杯中，加入50 mL乙腈溶解，冰浴条件下缓慢滴入上述烧瓶中，冰浴下搅拌1 h后缓慢升温至室温，薄层色谱，跟踪至反应结束。过滤、浓缩，柱层析纯化得目标产物Ⅱa-m。

1.3杀菌活性测定

采用菌丝生长速率抑制法[18]，以霉灵为对照药剂，测定目标化合物对小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌的室内杀菌活性。将供试药液配制成0.1～1.6 mmol/L之间的梯度浓度，设3次平行试验。小麦赤霉病菌培养54 h、棉花枯萎病菌培养70 h后，采用十字交叉法测定各药剂处理和空白对照的菌落直径，取平均值后，按公式（1）计算各药剂对病原菌的生长抑制率，将菌丝生长抑制率换算成抑制概率值Y，药剂浓度换算成浓度对数X。按浓度对数与概率值回归法求得不同化合物对小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌的毒力公式y=a+bx，并由毒力公式计算各药剂抑制中浓度（EC50）。

抑制生长率=空白对照组菌落直径-药剂处理组菌落直径空白对照组菌落直径-打孔器内径×100%。（1）

2结果与分析

2.1结构鉴定

化合物的理化性质和元素分析数据见表1，核磁共振氢谱数据见表2。

2.2杀菌活性

从表3可知，目标化合物对这2种供试病原菌均有很好的活性，部分化合物与霉灵的活性相近。不同的氨基酸结构对衍生物的活性影响有差异，其中，氯甲酸苄酯保护的丙氨酸（Ⅱb）、脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）与霉灵的耦合物，对小麦赤霉病菌的活性均显著高于霉灵本身；氯甲酸苄酯保护的脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）与霉灵的耦合物对棉花枯萎病菌的活性均高于霉灵。

3结论与讨论

本研究以霉灵和氨基酸为原料，采用N，N′-环己基碳二亚胺脱水缩合衍生合成的方法，合成了13个未见报道的 N-苄氧羰基-氨基酸-霉灵，所有化合物的结构均通过核磁共振氢谱和元素分析的确认，该反应条件温和，产物纯化处理简单。初步的生物活性测定结果表明，目标化合物不仅保留了霉灵原有的杀菌活性，而且接入不同氨基酸的结构对衍生物活性影响存在差异，其中含杂环、苯环或杂原子的脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的衍生物活性优于其他氨基酸衍生物。氨基酸是自然界的重要物质，具有重要的生理功能[19]，其本身具有杀虫、杀菌和促进植物生长的作用[20-21]。另外，在细胞膜上存在大量氨基酸的转运载体[22]，这些载体协助氨基酸进入细胞，并能增加氨基酸在生物体内的运转。农药分子与氨基酸基团耦合后，如果没有屏蔽氨基酸与其载体的结合部位，在一定程度上仍然可以与其载体结合，从而增加生物体对耦合物的吸收，并有可能改善耦合物在生物体内的传导，从而提高耦合物的杀菌活性。

Xu等将谷氨酸与拌种灵耦合后，施用于烟草植株的中部叶片，在植株顶端和根部都检测到了该衍生物，且在植株顶端有一定的积累性，说明拌种灵与谷氨酸耦合后传导性得到了改善[23]。本试验合成的霉灵-氨基酸衍生物在植物体内是否具有类似的传导性，以及传导性与氨基酸种类之间是否具有相关性，有待进一步研究。

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