饲粮纤维水平对初产母兔瘦素分泌及其基因表达的影响

邝良德++任永军++谢晓红++雷岷++郭志强++李丛艳++郑洁++张翔宇++张翠霞++杨超++邓小东

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.078

摘要：为研究饲粮不同纤维水平对初产母兔血清中瘦素含量以及卵巢组织中OB、OB-R基因表达的影响，选取165日龄的新西兰青年母兔240只，随机分为4个处理，分别为12%、14%、16%、18%纤维水平添加组，每个处理设5个重复，每个重复12只，每个处理共60只。结果显示，从配种到分娩，各处理组的母兔血清中瘦素含量均呈上升趋势。不同处理组相比较，母兔血清中瘦素含量存在显著差异，其中16%添加组的母兔血清瘦素含量最高。基因表达研究表明，16%添加组的母兔卵巢中，OB、OB-R基因的表达量显著高于其他各试验组。饲粮不同纤维水平对初产母兔瘦素分泌影响显著，初产母兔饲粮中纤维的适宜添加水平为16%。

关键词：纤维；母兔；OB基因；OB-R基因；卵巢；基因表达

中图分类号： S829.15文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0281-03

收稿日期：2016-04-08

基金项目：四川省公益性科研院所基本科研业务费项目（编号：SASA2015A10）；四川省“十二五”畜禽育种攻关项目（编号：2011NZ0099）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303143-5）；国家兔产业技术体系（编号：CARS-44-B-4）；动物遗传育种四川省重点实验室运行补助项目。

作者简介：邝良德（1983—），男，湖南郴州人，硕士，助理研究员，主要从事家兔遗传育种及饲养研究。E-mail：happyboy5851258@163.com。

通信作者：任永军，硕士，助理研究员，主要从事家兔饲养及疫病防控研究。E-mail：360167513@qq.com。粗纤维泛指植物性来源纤维成分，包括纤维素、半纤维素、果胶、植物胶、黏多糖、木质素等，主要存在于植物的细胞壁中。国内外研究表明，粗纤维是家兔最重要的营养素之一，对家兔具有特殊的生理作用，在构成合理日粮结构、维持家兔正常生理功能、初产母兔繁殖及胚胎成活率等方面起着极为重要的作用。瘦素（leptin）是肥胖基因（obesegene，ob）编码的产物，是一种分泌性蛋白质类激素。OB基因是1条含167个氨基酸密码的DNA序列，包含有2个外显子、1个内含子。Hindlet等研究发现，缺陷ob/ob（缺乏功能性瘦素）雌鼠不仅表现出肥胖，还出现生殖功能障碍，持续注射外源性瘦素后可恢复生殖功能，由此证明瘦素与生殖功能有关[1-2]。瘦素受体由db基因（diabetes gene）编码，为高度特异的跨膜蛋白质，与瘦素具有高度亲和力。最初认为瘦素只在白色脂肪组织中表达，之后研究发现，瘦素在下丘脑、垂体、肺、胃底部上皮、骨骼肌、卵巢、子宫内膜、合体滋养层细胞、乳腺上皮等均有表达，且在卵巢、子宫内膜中与瘦素受体同时表达[3-4]。

瘦素及其受体在下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的多处表达，表明瘦素对生殖的调节是通过旁分泌或内分泌方式对HPG轴不同水平进行复杂的网络式调节，从而对哺乳动物的繁殖机能发挥重要作用[5-7]。适宜的粗纤维水平对家兔繁殖生产具有重要意义；因此，通过深入研究不同粗纤维水平对初产母兔瘦素分泌及其基因表达的影响，为降低母兔淘汰率、死亡率，综合提高母兔繁殖性能提供前提条件和基础。

1材料与方法

1.1试验设计及母兔饲养管理

选择相同日龄（165日龄）的新西兰青年母兔240只，随机分为4个处理，每个处理设5个重复，每个重复12只，每个处理共60只。试验期为母兔165日龄至第1胎分娩，4个处理分别饲喂12%、14%、16%、18%水平纤维的日粮，所有日粮均按美国NRC肉兔饲养标准配制。分别于母兔配种当天、妊娠21 d、分娩当天从每个重复中选择4只母兔，每个处理共20只，进行耳缘静脉采血，分离血清并于-20 ℃保存待测。同时，在以上日龄的每个重复中选择1只母兔，每个处理5只，共计60只，进行屠宰并采集卵巢组织样品，于-80 ℃保存，用于瘦素及瘦素受体mRNA表达量的测定。

1.2试验日粮及营养水平

按照美国NRC肉兔饲养标准配制全价料，试验日粮组成及营养成分见表1。在日粮中添加苜蓿草粉，将日粮粗纤维水平分别调整为12%、14%、16%、18%，即试验1、2、3、4组。所有试验母兔均饲养在同一兔舍内，自由采食、自动饮水。

1.3主要仪器及试剂

Biowave DNA型核酸蛋白检测仪，Power Pac 3000型电泳仪，岛津UV2600型紫外分光光度计，Polytron PT1200E型电动匀浆器，Bio-rad iCycler iQ型定量PCR仪，日立CR22g型高速冷冻离心机，Versa Doc 1000型凝胶成像系统，无菌操作工作台。兔瘦素（leptin）ELISA测定试剂盒为基因美公司产品，Trizol试剂、PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM均为TaKaRa公司产品。

1.4试验指标测定

1.4.1血清瘦素水平测定分别取-20 ℃冰箱中冷冻保存的血清样品，每个样品取0.5 mL进行瘦素水平测定。血清瘦素的测定采用酶联免疫吸附法（ELISA），利用紫外分光光度计（酶标仪）进行读数。

1.4.2瘦素及瘦素受体基因mRNA表达量的测定采用Trizol法提取各组织样品中的总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的质量和完整性，将质量合格的RNA置于 -80 ℃ 冰箱中冻存备用。参照PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA模板，反转录产物于 -20 ℃ 保存备用。根据GenBank公布的家兔瘦素基因（OB）、瘦素受体基因（OB-R）、内参基因GAPDH序列，使用Primer 5.0软件设计引物扩增OB、OB-R、GAPDH基因。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成，引物序列及参数见表2。以GAPDH为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测OB、OB-R基因在初产母兔卵巢组织中mRNA表达量的变化规律。RT-PCR体系（20 μL）为：1 μL反转录产物、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、10 μmol/L的上下游引物各0.6 μL、7.8 μL超纯水。采用iCycler型荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）进行扩增，PCR条件为：95 ℃ 90 s；95 ℃ 15 s，63 ℃ 20 s，42个循环；72 ℃ 15 s。每个样品设3个平行样。所得到的CT值（cycle threshold）采用2-ΔΔCT方法[8]计算。目的基因mRNA表达水平通过内参基因GAPDH进行校正。

1.5数据统计分析

采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，采用Duncans检验进行多重比较和显著分析。所有数据均为“平均值±标准误”，显著性水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01。

2结果与分析

2.1纤维水平对初产母兔瘦素分泌的影响

由表3可知，配种当天各处理组母兔血清中的瘦素含量存在差异，其中试验3组瘦素含量最高，显著高于其他试验组（P<0.05），试验1、2组显著高于试验4组（P<0.05）。在妊娠21 d，试验3组瘦素含量最高，显著高于试验1、4组（P<0.05），试验1组与试验4组之间差异不显著。在分娩当天，试验3组瘦素含量显著高于其他各试验组（P<0.05），试验1组与试验4组之间差异不显著，试验1组瘦素含量最低。从配种到分娩，各处理组母兔血清中的瘦素含量均呈上升趋势。

2.2纤维水平对初产母兔卵巢组织中OB基因表达的影响

由表4可知，配种当天各处理组母兔卵巢组织中的OB基因表达量存在显著差异，其中试验3组OB基因表达量最高，显著高于其他各试验组（P<0.05），试验4组表达量最低，试验1组与试验2组之间差异不显著。在妊娠21 d，试验3组OB基因表达量最高，表达量依次为试验3组>试验1组>试验2组>试验4组。在分娩当天，试验3组OB基因表达量显著高于其他各试验组（P<0.05），试验1组与试验4组之间差异不显著。从配种到分娩，各处理组母兔卵巢组织中的OB基因表达量均呈显著上升趋势。

2.3纤维水平对初产母兔卵巢组织中OB-R基因表达的影响

由表5可知，饲料中纤维水平对初产母兔卵巢组织中的OB-R基因表达有显著影响。在配种当天， 各处理组母兔卵巢组织中的OB-R基因表达量存在差异，其中试验3组 OB-R基因表达量最高，显著高于其他各试验组（P<0.05）。在妊娠21 d，试验3组OB-R基因表达量最高，显著高于其他各试验组（P<0.05），试验4组表达量最低。在分娩当天，试验3组OB-R基因表达量显著高于其他各试验组（P<0.05），表达量依次为试验3组>试验2组>试验4组>试验1组。从配种到分娩，试验2、3、4组母兔卵巢组织中的OB-R 基因表达量均呈显著上升趋势，试验1组则表现为先升高、后基本维持不变。

3结论与讨论

作为分泌性蛋白质类激素，瘦素通过与其受体发生特异性结合来发挥作用。瘦素水平呈生理性波动，卵泡早期瘦素水平较低，于排卵期达到高峰。瘦素可激活磷酸二酯酶水解第二信使cAMP，刺激胚泡的分裂，从而导致卵细胞的成熟[9-10]。已有研究表明，瘦素可促进卵泡刺激素（FSH）、促黄体激素（LH）、雌二醇（E2）的产生，影响卵巢的生殖能力，体内瘦素水平过低将导致女性不孕。Barashi等每天给小鼠注射瘦素，发现小鼠的LH、FSH水平明显升高，表明瘦素可在一定程度上提高动物卵巢的生殖功能；小鼠在瘦素水平极低的情况下出现不孕症现象，而注射瘦素后生育功能得到改善[11-12]。为禁食蛋鸡注射外源瘦素，结果发现，在禁食期间注射瘦素可抑制卵泡的衰亡，蛋鸡产蛋行为的停止被延迟，由此可见瘦素具有抑制卵巢功能退化、提高鸡繁殖性能的作用[13-14]。本试验结果表明，从配种到分娩，各处理组母兔血清中的瘦素含量均呈上升趋势，这与母兔卵巢组织中OB、OB-R基因表达量基本符合。不同纤维水平添加组之间相比较，母兔血清中的瘦素含量存在显著差异。在各试验阶段，试验3组母兔血清中的瘦素含量均最高。在基因表达方面，试验3组母兔卵巢中的OB、OB-R基因表达量显著高于其他各试验组。饲粮不同纤维水平对初产母兔瘦素分泌影响显著，初产母兔饲粮中纤维的适宜添加水平为16%。

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