转CP4—EPSPS基因大豆对大鼠的致突变研究

史宗勇++路超++唐中伟++赵成萍++陈卫国++马艳琴++袁建琴

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.080

摘要：以SD大鼠为试验动物模型，分别饲喂含转CP4-EPSPS基因大豆和常规大豆饲料，以转基因大豆饲料饲喂大鼠为试验组，常规大豆饲料饲喂大鼠为对照组，择期进行精子畸变试验、显性致死试验和致畸试验。结果表明：试验组和对照组相比精子畸变率无显著差异（P>0.05），二者与阳性对照组差异显著（P<0.05）；显性致死试验中试验组与对照组胚胎死亡率无显著差异（P>0.05）；致畸试验中2组活胎同性别间的体质量、体长、尾长、前肢长度均无显著差异，经活胎外表检查、骨骼检查、内脏检查无畸形。结果说明，喂食转CP4-EPSPS基因大豆饲料对大鼠精子畸变、胚胎致死、胎仔畸形无不良影响，不存在生殖毒性。

关键词：转CP4-EPSPS基因大豆；精子畸变；显性致死；致畸试验

中图分类号： S565.101文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0286-03

收稿日期：2015-08-13

基金项目：山西省自然科学基金（编号：2013011028-2）；山西省科技攻关基金（编号：20140311025-3）。

作者简介：史宗勇（1970—），男，山西太谷人，硕士，副教授，从事动物生理与转基因生物安全的研究。E-mail：zongyongtg@sohu.com。1988年世界第一例转基因大豆诞生[1]，自1996年美国首次批准Monsanto（孟山都）公司抗草甘磷转基因大豆商业化种植19年以来，其种植面积在全球范围内不断扩大，2014年全球转基因大豆种植面积达0.90亿hm2，占当年转基因作物总面积1.815亿hm2的近50%，更是占全球大豆种植面积的82%[2]。抗除草剂大豆GTS-40-3-2累计获得26个国家和欧盟28个成员国的52次批准，是全球获得监管机构批准频次最多的作物，也是应用最为广泛的转基因作物之一[3]。抗除草剂大豆GTS-40-3-2是在Soy-bean A5403大豆中导入从天然农杆菌菌系CP4中分离出的具有抗草甘膦功能的EPSPS酶，使植株对草甘膦不敏感，能够忍受正常剂量或更高剂量的草甘膦而不被杀死，从而获得重大效益。

目前，国内外对转基因大豆食用性安全的研究集中在其营养成分方面[4-5]，而动物试验主要集中在日常行为、脏器系数、组织病理学、血液学和血清化学等分析，大多数研究结果显示转基因大豆是安全的[6-7]。Qi等以复合性状转基因大豆（35 423×40-3-2）喂养SD大鼠90 d后，发现大鼠的脏器系数、血常规和血生化等指标存在少数显著性差异，但这些差异与转基因成分无关且变量数值在正常范围内[8]。由于近年来关于转基因作物安全性的深入研究，转基因食品评价的实质等同性原则受到质疑，从手性D-氨基酸（DAA）角度考量，转基因食品和传统食品的安全性不实质等同[9-10]，转基因食品的食用安全性受到了社会和公众的广泛关注。

哺乳动物生殖过程中，精子的形成和胚胎的发育对外界剌激极为敏感，易受化学、环境因素的影响而发生畸变，而且这些潜在的生殖毒性对生物个体和种群的影响是长期的。当前关于转CP4-EPSPS基因大豆致畸效应研究和报道较少。本试验以SD大鼠为动物模型，评估喂食转CP4-EPSPS基因大豆对大鼠生殖过程致畸性的影响，进而探讨转CP4-EPSPS基因大豆的潜在生殖毒性作用。

1材料与方法

1.1实验动物分组及处理

雄、雌各60只30日龄SD大鼠购自山西医科大学实验动物中心，按性别分类组群，分笼饲喂。适应性喂食7 d后，各群内随机取30只，喂食含转基因大豆豆粕加工的饲料（GM组），其余30只喂食含常规大豆豆粕的饲料（CK组），按国家实验动物饲养标准喂食，根据试验进程随机挑选大鼠进行试验。

1.2饲料

试验用转基因大豆豆粕为孟山都远东有限公司抗农达GTS40-3-2大豆加工品，对照组常规大豆豆粕为其亲本 Soy-bean A5403大豆加工品。转基因豆粕经农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（太原）检测确认含CP4-EPSPS外源基因。大鼠饲料委托山西医科大学实验动物中心加工，2种饲料组成成分配比相同，其中豆粕成分占比20%，除豆粕外其余成分来源一致，饲料经检测符合GB 149243—2010《实验动物配合饲料营养成分》要求。

1.3主要试剂与器材

磷酸盐缓冲液、生理盐水、甲醇、伊红、丝裂霉素C（MMC）、乙醇、氢氧化钾、茜素红、冰醋酸、甘油、水合氯醛、氢氧化钾、鲍音（Bouin）氏液；生物显微镜、解剖刀、剪刀、镊子、眼科剪、眼科镊、单面刀片、注射器等。

1.4方法

1.4.1精子畸变试验取70 d龄体质量相近的雄性大鼠共15只，其中CK组10只，平均分为2组，设为阳性对照组和正常对照组，GM组5只设为试验组。阳性对照组大鼠腹腔注射丝裂霉素C（MMC）1.1 mg/（kg·d）连续处理5 d，给药剂量参照傅剑云等小鼠精子致畸数据结合药理实验等效剂量系数折算法换算确定[11]。正常对照组和试验组不做任何处理。处理期间和处理后各组仍按试验设计分组进行饲喂。喂食42 d后颈椎脱臼法处死大鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾置于生理盐水中，用剪刀剪碎，用吸管轻轻吹打悬浮液5～6次后静置3～5 min，用4层擦镜纸过滤组织碎片，取滤液滴于洁净载玻片上，均匀推片。晾干后用甲醇固定5 min，伊红染色1 h，用水轻轻冲洗，干燥后进行镜检。在高倍镜下观察500个精子的形态，计算精子畸变率。精子畸变率=畸变精子数/总检测精子数×100%。

1.4.2显性致死试验在CK组、GM组内选取70 d龄体质量相当的大鼠，每组选取雌性15只，雄性5只，组内按雌雄比3 ∶1交配，下午18：00同笼，次日08：00雌雄分笼，随即冲洗雌鼠阴道制做涂片检查精子，以查到精子为受孕0 d，受孕 21 d 剖腹取出即将分娩孕鼠的子宫，辨认子宫内的活胎、死胎、吸收胎数。

1.4.3胚胎生长发育情况每组随机选取显性致死试验雌性孕鼠3只，称量胎鼠体质量，测体长、尾长、前肢长。将胎仔按子宫内位置顺序编号。单数的胎仔放入80%的乙醇溶液中固定5 d，用1%的氢氧化钾溶液浸泡5 d，至肌肉透明可见骨骼，然后用茜素红染色3 d至骨骼染成紫色，置于透明液中2 d，做骨骼畸形检查。编号双数的胎仔放入鲍音（Bouin）氏液中固定10 d后，取出标本用自来水洗去固定液，用单面刀片沿口经耳做水平切面查口腔；将切下的颅顶部，沿眼球前缘垂直作额状切面查鼻道；然后沿着眼球正中垂直作第二额状切面，检查眼球、脑室；沿眼球后缘垂直作第三额状切面，检查脑、脑室。之后沿胸、腹壁中线和肋下缘水平线作“十”字切口，暴露胸腔、腹腔及盆腔内的器官，做内脏畸形检查。

2结果与分析

试验期间，各组试验动物活动正常，生长发育良好，被毛浓密有光泽，未见外观体征、行为活动和饮食方面异常，也未发生死亡现象。

2.1转CP4-EPSPS基因大豆对大鼠精子畸变的影响

试验组、对照组和阳性对照组在喂食42 d后取附睾精子进行试验，发现3组均有畸变精子，由图1可知，异常精子表现为胖头、双头及无头等。

将精子镜检结果进行统计分析后发现，试验组、正常对照组与阳性对照组精子畸变率具有极显著性差异（P<0.01），说明阳性对照显著，结果成立。试验组和正常对照组相比，采用t检验P值为0.147（P>0.05），无统计学意义（表1）。

2.2显性致死试验

剖腹取出即将分娩母鼠的子宫，辨认子宫内的活胎、死胎、吸收胎数。检查发现活胎胎仔完整成形，肉红色，能自然运动，对机械刺激有运动反应；胎盘较大呈红色，发育正常。晚死胎胎仔完整成形、灰红色、无自然运动，对机械刺激无反应；胎盘灰红色、较小。吸收胎呈暗紫或浅色点块，不能辨认胚胎和胎盘。对各受孕组统计分析表明：试验组和正常对照组平均着床数（P=0.688）、胚胎死亡率（P=0.994）差异不显著（表2）。

2.3致畸试验

解剖母鼠子宫逐一详细察看，行胎仔外部检查，发现全部胎仔外观检查正常无畸形。测量活胎体质量、体长、尾长和前肢长度（图2），各组按胎仔性别归类，经统计学分析，2组间雄性胎仔、雌性胎仔各指标t检验P值全部大于0.05，表明两组间同性胎仔生长发育无显著差异。

用放大镜检查处理好的胎仔骨骼透明标本，可见试验组、对照组均有少数胸骨、颅骨发育不全，肋骨、椎骨、四肢骨数量正常，各骨形态、大小未见异常。

经内脏检查，发现活胎仔口腔无腭裂、舌缺或分叉；鼻道无扩大、单鼻道等畸形；眼球形态正常成双；无脑水肿积水，无脑室扩大；胸腔、腹腔内心脏和呼吸、消化、泌尿、生殖等主要器官数目、形态、位置无异常，大小匀称无异常。内脏检查无畸形。

3讨论与结论

精子畸变试验通过观察精子形态的变化，检测受试物对实验动物精子形成过程的影响，在可引起生殖细胞遗传性损伤的因素作用下，动物睾丸产生的畸形精子数可大量增加，雄性动物接触受试物后精子畸变率的改变，可反映该受试物的生殖毒性和对生殖细胞的致突变性。试验结果发现，试验组精子畸变率2%，处于大鼠的精子正常畸变范围0.8%～3.4%[12]，与对照组相比亦无明显差异，表明喂食含转CP4-EPSPS基因大豆饲料不会影响实验大鼠的精子畸形率，与张奕等对转GL融合蛋白基因大米对SD大鼠的亚慢性毒性试

验研究的精子畸变结果[13]一致。本试验精子畸变结果也与芦春斌等喂食转基因大豆对小鼠精子存活率与畸形率影响的研究结果[14]相似。

显性致死试验通过观察大鼠胚胎死亡情况，检测受试物诱发哺乳动物生殖细胞的染色体畸变，反映受试物对哺乳动物生殖细胞的致突变性。试验结果显示，试验组与对照组的平均着床数和胚胎死亡率均无显著差异，表明CP4-EPSPS基因大豆未导致实验大鼠染色体结构异常或染色体数目变化。芦春斌等研究也表明，喂食转基因大豆对大鼠早期胚胎发育无不良影响[15]。

致畸试验是应用实验动物鉴定外来受试物致畸性的试验，母体在孕期如受到可通过胎盘屏障的有害物质作用，就会影响胚胎的正常发育与器官分化，导致胚胎结构和机能的缺陷，表现出畸胎，从而检测受试物导致胚胎结构畸形及生长迟缓等毒性作用。参考余梦瑶等对转基因棉籽壳栽培毛木耳安全性评价时采用在动物的器官敏感期进行染毒的检测方法对转基因大豆进行检测[16]。试验未发现转基因大豆对胎鼠的形成、发育、外观、骨骼及内脏等有致畸作用。本试验结果与张珍誉等对转Bt基因稻谷的研究结果[17]相同。

本试验研究结果表明，喂食转CP4-EPSPS基因大豆饲料对雄性大鼠精子畸变、孕鼠胚胎致死、胎仔畸变效应无明显影响，说明转CP4-EPSPS基因大豆对大鼠无明显生殖毒性。

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