野生鱼腥草甲醇提取物工艺优化及其抗氧化活性

罗秋水++周志娥++汤凯洁++李奔++刘鹏飞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.098

摘要：为研究并优化野生鱼腥草甲醇提取工艺及其体外抗氧化能力，在单因素试验的基础上设计正交试验，通过方差分析、多重比较确定最优提取工艺。用羟基自由基（·OH）的清除作用、总抗氧化能力、1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·）清除作用及清除亚硝酸盐（NO-2）能力的测定方法评价甲醇提取物体外抗氧化活性。结果表明：最佳提取工艺条件为料液比1 g ∶35 mL、提取时间1.0 h、提取温度80 ℃、甲醇体积分数70%；甲醇提取物在0～1 mg/mL浓度范围具有明显的抗氧化活性，并且随着浓度的增大，活性增强；当甲醇提取物的浓度为1 mg/mL时，其对羟基自由基的清除率达到50.23%，对DPPH·的清除率达78.86%，对亚硝酸盐的清除率高达8724%；与对照品维生素C相比，提取物的总抗氧化能力与其接近。因此可知，野生鱼腥草甲醇提取物具有明显体外抗氧化活性。

关键词：野生鱼腥草；甲醇提取物；提取工艺；抗氧化活性

中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2016）10-0337-03

收稿日期：2015-09-11

基金项目：国家自然科学基金（编号：31101294）。

作者简介：罗秋水（1977—），男，江西樟树人，硕士，实验师，从事食品质量与安全研究。E-mail：lqsh2001@126.com。

通信作者：汤凯洁，博士，副教授，从事食品质量与安全研究。E-mail：tkjie999@sina.com。鱼腥草（Houttuyniae）别称紫蕺、野花麦、折耳根等，主要分布于中国中部、东南及西南部各省（区），以长江以南各省份为主，包括川、鄂、赣、湘、黔等省[1]。鱼腥草在民间传统中医上具有一定的药用价值[2]，其中所含的功效成分包括黄酮类化合物、挥发性物质、多糖等，其中黄酮类化合物包括榭皮素、榭皮苷、瑞诺苷、芸香苷等[3]。在现代医学中，鱼腥草广泛应用于治疗肺脓疡、痰热咳嗽、尿路感染等。鱼腥草的主要抗菌成分是鱼腥草素，对各种致病菌、流感病毒等有抑制作用[4-6]，特别是对金黄色葡萄球菌抑制作用非常明显。近年来又发现鱼腥草有新的用途，如治疗喘息型肺炎，此外对病毒性心肌炎、小儿呼吸感染均有疗效。目前，随着医学领域对鱼腥草研究的深入，鱼腥草化学成分的作用机理更加清晰，药用价值及食用价值已被越来越多的人重视。鱼腥草兼具食品保健功能特性，生物活性成分较高，与西药相比具有特殊医药功效[7]，因此鱼腥草的药用价值、食用价值的前景将十分可观。本研究通过鱼腥草甲醇提取物的体外抗氧化活性试验，以期为野生鱼腥草的进一步充分利用提供参考和借鉴。

1材料与方法

1.1材料与试剂

野生鱼腥草采摘于江西农业大学校内。邻菲罗啉，天津永大化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·），北京中生瑞泰科技有限公司；维生素C、无水乙醇、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、双氧水、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、氢氧化钠、浓硫酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、柠檬酸、草酸、磷酸钠、氨基苯磺酸钠，均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

723可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；BS224S 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DZG-6020真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；移液器，Thermos；SB-3200DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV752紫外-可见分光光度计，上海诺科仪器仪表有限公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；XY-200高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金工具厂；TCL5M台式低速大容量冷冻离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.3野生鱼腥草甲醇提取工艺优化

1.3.1单因素试验设计称取1.0 g鱼腥草粉末，以甲醇体积分数60%、料液比1 g ∶mL、提取温度70 ℃、提取时间1 h为单因素试验的基础条件。当研究某一因素时，使其他条件保持不变。甲醇体积分数分别设为50%、60%、70%、80%、90%，料液比分别设为1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL、1 g ∶40 mL，提取时间分别设为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取温度分别设为50、60、70、80、90 ℃。按上述设计分别做单因素不同水平的试验，所得提取物在电热恒温鼓风干燥箱中烘干，按照下面公式计算提取物得率：

提取物得率=（m2-m1）/m0×100%。

式中：m2为空瓶+提取物质量，g；m1为空瓶质量，g；m0为样品质量，g。

1.3.2正交试验设计为了综合考虑各因素对野生鱼腥草甲醇提取物得率的影响，根据上述单因素试验结果，选取甲醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度4个因素，采用 L9（34） 正交设计对野生鱼腥草甲醇提取条件进行优化，正交试验因素水平详见表1。

1.4野生鱼腥草甲醇提取物的测定

1.4.1野生鱼腥草甲醇提取物的制备及提取得率计算将野生鱼腥草清除黄叶、洗净、烘干、剪碎、粉碎后放入干燥器中

1.4.2甲醇提取物浓度和对照品维生素C的配制准确称取0.500 g甲醇提取物，配制成浓度为1 000 μg/mL的样品溶液，并以此为基准，逐步稀释配制200、400、600、800、1 000 μg/mL 的样品溶液。按同样方法配制同样系列浓度梯度的维生素C标准液，将二者存储于冰箱备用。

1.4.3对羟基自由基（·OH）的清除作用参考邻二氮菲-金属离子-H2O2[8]，同时采用Fenton反应（H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+）获得羟基自由基，反应过程中将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，通过全波长扫描发现，在 510 nm 处最大吸收峰消失，从而可以在510 nm处测其吸光度，通过测定样品在该波长处的吸光度可判断羟基自由基存在的量，并以此计算羟基自由基清除率。具体方法：（1）取磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH值=7.4）2.0 mL于试管中并加入8.0 mL蒸馏水，摇匀作为空白管；（2）取2.0 mL磷酸盐缓冲液、1.5 mL 5 mmol/L邻二氮菲、1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁和5.5 mL蒸馏水于试管中，摇匀作为未损伤管A；（3）以A管为基准，在此基础上加入0.1% H2O2 1.0 mL、蒸馏水 4.5 mL，摇匀作损伤管并标记为B；（4）以B管为基准，在该基础上分别加入1.0 mL各样品溶液，摇匀后作为样品管并标记为C；（5）将上述所有试管混匀后置于37 ℃恒温水锅中保温30 min，然后取出并定容到10 mL，在波长510 nm处测定吸光度。根据以下公式计算各个浓度对羟基自由基清除率：

·OH清除率=[（DC-DB）/（DA-DB）]×100%。（1）

1.4.4清除亚硝酸盐（NO-2）的能力[9-10]分别取3 mL各浓度的样液加入到具塞试管中，用柠檬酸缓冲液（pH值=3.0）定容至5 mL。分别向每支管中加入0.1 mL亚硝酸钠（200 μg/mL），混匀后立即置于37 ℃恒温水浴锅中保温 1.5 h。同时，空白管不加亚硝酸钠；亚硝酸钠标准管不加亚硝酸钠及样品，其余相同。通过盐酸萘乙二胺比色法[11]测定各管的吸光度（D540 nm）。根据以下公式计算各个浓度对亚硝酸盐（NO-2）的清除率：

NaNO2清除率= [D标-（D样-D空）]/D标×100%。（2）

1.4.5清除DPPH·的清除作用[12]甲醇提取物清除DPPH·能力的测定：取10 mg DPPH标准品，用95%乙醇为溶剂配制质量分数为10%的溶液；各取1 mL甲醇提取物样液于试管中，然后迅速加入3 mL配制好的DPPH乙醇溶液，快速摇匀并且置于室温阴暗处反应30 min；然后将反应后各管迅速取出并在波长为517 nm处测定吸光度（Da）；同时按上述比例分别测定溶剂与DPPH混合后的吸光度（Dc）、试剂与样液混合后的吸光度（Db）。按下式计算DPPH·清除率：

DPPH·清除率=[1-（Da-Db）/Dc]×100%。（3）

1.4.6总抗氧化力各取0.4 mL不同浓度的鱼腥草甲醇提取液加入试管中，然后依次加入28 mmol/L磷酸钠、0.6 mol/L 硫酸、4 mmol/L钼酸铵，各4 mL，混匀后并置于 95 ℃ 恒温水浴锅中90 min，然后冷却至室温并在波长 695 nm 处测其吸光度；以蒸馏水组作为空白管，所有测定均做3次平行试验[13]。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

当提取时间为0.5～1.5 h时，甲醇提取物得率增加速度较快；当提取时间1.5～2.5 h时，甲醇提取物得率变化趋势有增有减。从节省时间来考虑，选取提取时间为1.0、1.5、2.0 h 做正交试验。当乙醇体积分数为70%时，甲醇提取物得率最大，之后得率明显下降。从提取效果、减少溶剂用量考虑，分别选择乙醇体积分数为60%、70%、80%做正交试验。当提取温度为40～50 ℃时，甲醇提取物浓度较快增加至最大值，之后甲醇提取物浓度先降低再升高。从经济角度考虑，选取温度70、80、90 ℃做正交试验。甲醇提取物得率随料液比增加一直增大，在料液比为1 g ∶30 mL后增大缓慢。从提取效果和减少溶剂用量角度考虑，分别选择料液比为 1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL做正交试验。

2.2正交试验结果、方差分析及多重比较

由表2正交设计试验可知，通过极值R大小得出各因素对提取物提取得率影响大小依次为料液比>甲醇体积分数>提取时间>提取温度。由表3方差分析可知，料液比、甲醇体积分数、提取时间、提取温度4个因素对提取物提取率的影响都极显著。由表4多重比较得出，最佳提取工艺为A3B1C2D2、A3B3C2D2。通过验证试验，得出A3B1C2D2提取率最大，比正交表中的任何值还大，所以选择最佳提取工艺条件为A3B1C2D2，此时提取得率为19.13%。

2.3对羟基自由基的清除作用

由图1可知，甲醇提取物对羟基自由基的清除作用随着浓度增加逐渐增大；当浓度在0～600 μg/mL范围内， 清除率呈直线增加；当浓度在600～800 μg/mL时，其清除率明显加快；之后的清除率略有增加但趋势变缓，在1 000 μg/mL浓度下维生素C对羟基自由基清除率达到75.49%，而样品清除率为50.23%。

2.4总抗氧化能力

自由基含有1个不成对的电子原子团，在形成分子时，自由基就会夺取其他物质的1个电子， 从而使自己变得更加稳定，这种现象称为氧化[14]。由图2可以看出，鱼腥草甲醇提取物D695 nm在浓度0～1000μg/mL范围内随浓度增大而提高，其总抗氧化能与维生素C基本平行增大且接近。

2.5对DPPH·的清除作用

DPPH·乙醇溶液呈紫色，最大吸收波长为517 nm。当加入自由基清除剂到DPPH溶液中时，其孤电子成对，吸收消失或减弱，从而使溶液颜色变浅，并在517 nm处的吸光度变化趋势与自由基清除率呈线性相关。因此，该法可以用来检测某种物质对自由基的清除能力，清除率越大则证明其清除自由基能力越强。由图3可以看出，甲醇提取物对DPPH·清除率在0～1 000 μg/mL范围内一直增大，当浓度为 1 000 μg/mL 时，清除率达78.86%；对照品维生素C对 DPPH· 清除率与甲醇提取物趋势基本相同，但相比之下后者的清除效果更好，在1 000 μg/mL时清除率高达92.78%。

2.6清除亚硝酸盐（NO-2）的能力亚硝胺类物质能引起诸多慢性或恶性肿瘤。虽然在正常情况下，人们直接摄入该类致癌物的量几乎可以忽略，但食物中可形成N-亚硝胺类的前体物质却大量存在，其中亚硝酸盐是能够形成N-亚硝胺类的前体物质[15]。由图4可以看出，在0～200 μg/mL范围内，维生素C对亚硝酸的清除能力均随着浓度的增加迅速增大，之后增加比较平缓；当浓度升高到1 000 μg/mL时，清除率达到96.75%；甲醇提取物的浓度在0～200 μg/mL时清除亚硝酸的能力先增大后基本保持不变；但是当浓度达到600 μg/mL后，其清除能力又迅速增大，并且在1 000 μg/mL时清除率高达87.24%。

3结论

根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验对提取物的提取工艺进行优化设计，料液比、甲醇体积分数、提取时间、提取温度对提取物得率影响均差异极显著。各因素对提取物得率影响排序为料液比>甲醇体积分数>提取时间>提取温

度。通过方差分析和多重比较后进行验证试验，可知最佳工艺参数：料液比为1 g ∶35 mL、提取时间为1.0 h、提取温度为 80 ℃、甲醇浓度为70%，此时提取得率为19.13%。

甲醇提取物在0～1 000 μg/mL浓度范围内有较明显的抗氧化活性，各指标活性随着浓度的增加而增强；当甲醇提取物的浓度为1 000 μg/mL时，甲醇提取物对羟基自由基清除率为50.23%，对1，1-二苯基-2-苯基自由基的清除率达到78.86%，对亚硝酸盐（NO-2）的清除率高达87.24%；甲醇提取物的总抗氧化能力和浓度呈正相关，与对照品维生素C相比，总抗氧化力变化趋势基本接近。

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