冻融作用对土壤微生物的影响综述

田路路++隽英华++孙文涛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.127

摘要：土壤微生物种类众多，分布广泛，对土壤及周围生物的影响很大。冻融作用在全球范围内普遍存在，通过改变土壤的理化性质，影响土壤微生物的生命活动。本文重点综述了微生物在细胞、基因蛋白质及生理代谢水平上对冻融作用的响应行为，简要阐明因冻融改变的土壤环境因子对微生物的影响，进一步分析冻融对微生物群落结构和生物量的改变机制，并对将来可能的研究方向进行展望。

关键词：土壤；冻融作用；微生物；生化特性；微生物量；群落结构；细胞；生理代谢水平；全球气候变暖

中图分类号： S154.34文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0438-05

收稿日期：2015-08-01

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（编号：41301253）；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划（编号：2014018）。

作者简介：田路路 （1990—），女，河南鲁山人，硕士研究生，从事冻融对土壤氮矿化影响方面的研究。E-mail： 760848132@qq.com。

通信作者：孙文涛。E-mail：wentaosw@163.com。土壤是一个固、液、气三相组成的高度异质环境，发育着丰富的微生物群落。微生物在土壤中分布广、数量大，土壤中栖息着微生物约100亿个/g[1]。土壤微生物参与矿化作用，分解有机质，释放C、N、P、S等矿质元素，具有解毒土壤、净化环境的作用[1]，影响土壤腐殖质及土壤团聚体的形成及其稳定性[2-4]，可进行生物固氮、增加土壤氮含量[1，5-6]，影响植物生长及病虫害的防治，在土壤生态系统及农业生产中都具有重要的地位[1]。冻融作用是在全球中高纬度和高海拔地区普遍存在的一种自然现象，是一种由于昼夜性、季节性或气候性的热量变化而在土壤表土及以下一定深度发生的反复冻结-融化现象[7]。全球受冻融作用影响的土地面积占陆地总面积的70%，北半球陆地表面超过一半地区会经历土壤冻融作用[8]，而我国北方地区具有土壤季节性冻融的重要气候特征。冻融作用可以明显改变土壤的物理、化学及生物学性质，如破坏土壤结构、影响团聚体稳定性、释放一部分可供微生物直接利用的营养元素、加强有机质的矿化作用、增强酶的活化效应等[9-11]。冻融对土壤理化性质及生物学性质的改变，不仅影响微生物自身的生存代谢活动，而且还影响其参与土壤中各种生理生化活动。

近年来，全球气候日益变暖，高纬度地区土壤积雪和冻融环境都可能发生变化[12-13]。Mellender等对瑞典欧洲赤松林的研究发现，气候变暖会使地表覆盖积雪减少，地表10 cm处平均温度上升，春季变暖时间提前，冻融循环次数增多[14]；Henry对加拿大31个气象站40年的气候和土壤温度数据进行分析也发现了类似现象[15]。这种全球变暖的现象直接改变了冻融的时间、强度及其频率，相应的冻融对土壤微生物的影响也将发生一定的改变。冻融作用不仅可以直接从内部影响土壤微生物，而且可以通过改变土壤的理化性质和生物学性质来从外部影响微生物。本研究主要综述冻融作用对土壤微生物自身内部特性的影响，冻融导致的土壤环境因子变化对土壤微生物的影响，以及冻融作用对微生物群落结构和生物量的影响，最后简要展望该领域研究在将来可能的发展方向。

1冻融对土壤微生物自身内部特性的影响

1.1冻融对微生物细胞的影响

首先，在冻融开始时，土壤温度下降至冻结，会将其中的微生物细胞冻伤，冻结产生的胞内冰晶体的增长造成细胞膜和细胞器的机械性损伤，从而引起细胞的形态发生变化[16]，这与一些学者的研究结论[17-18]相似。其次，冻结使未冻水中的溶质浓缩，改变土水势，细胞内外渗透压失去平衡，使细胞失水，细胞膜流动性降低，细胞壁受损[16，19]。朱琳等对乳酸菌细胞膜冻干损失的研究结果表明，冻结形成的冰晶会直接破坏膜结构，造成机械损伤，一般冰晶越大，细胞膜越易损伤破裂，造成细胞死亡[20]。另一方面，当细胞内水分逸出，缩水达到最小临界值时，细胞膜的渗透率产生不可逆的增加，导致原先不能透过膜的溶液也变成可渗透的，进而致使细胞死亡。此外，融化复水时可能发生的重结晶作用，也足以破坏细胞质膜或具膜的细胞器官[16]。

一般细胞内部高于-10 ℃不会冻结，但当细胞含水量小于10%时，即使温度降低到-40 ℃，细胞质也不会冻结[19]。这一现象说明细胞含水量对冻融作用中微生物细胞的冻结过程具有一定的影响，对于研究如何冷冻保存生物但又不破坏其细胞完整度及活性身份具有借鉴意义。

1.2冻融对微生物生理生物学的影响

1.2.1冻融对微生物生理学的影响冻融作用对微生物生理学方面的影响主要体现在2个方面，一是生理代谢活动，二是能量供应[21]。一般认为，多年冻土层中幸存下来的微生物大部分时间都处于休眠状态，仅在局部区域或时段具有一定的代谢活动能力[22]。Brinton等利用天冬氨酸外消旋作用的研究结果表明，微生物在-10 ℃下可生长繁殖4万多年，即微生物在冻结环境中仍可以从周围的冻土中得到可利用的养分来维持生存[23]。Gilichinsky等研究发现，虽然西伯利亚多年冻土微生物在-12～5 ℃的冻结过程中仍可以合成脂类，但在-1.5 ℃时其合成速度骤然降低，即受极端环境限制，微生物代谢活动微弱，仅能维持基本的生命活动[24]。总的来说，冻结时期能够存活下来的微生物的代谢水平分为3种情况：（1）代谢足以维持细胞生长；（2）代谢仅能维持细胞存活，不能支持细胞生长；（3）细胞进入休眠期，仅能在条件好转时进行代谢，以修复冻结期积累下来的受损物质[25]。

融化后的土壤微生物天冬氨酸利用率提高，丙氨酸利用率下降，而乳酸摄取能力基本不变[20，24]。在相同的培养条件下，经过冻融作用后苏醒的微生物与无经历冻融的微生物相比，前者的细胞增殖和菌落形成速率明显高于后者，虽然前者菌落总数较少，但其生存能力却强于后者或普通微生物[14，26]。

冻结会破坏细胞的膜结构，包括细胞中的具膜细胞器，如线粒体、叶绿体等。这就会直接导致依赖于膜或具膜细胞器而进行的生理代谢活动遭受影响或破坏，扰乱细胞内能量的产生、释放和利用[16]。众所周知，能量的供应水平与微生物的代谢水平密切相关，能量供应充足时，微生物代谢生长正常；能量供应缺乏时，微生物的代谢活动微弱，甚至会进入休眠状态或死亡[27]。

1.2.2冻融对微生物生物学的影响冻融对微生物生物学方面的影响主要体现在DNA和蛋白质合成表达方面。Price等研究发现，基因组为3 Mbp、蛋白质平均分子量为36 ku的微生物细胞，在冻结条件下，仅有不到1%的基因被复制，合成不到100个蛋白质分子[27]。可见，冻结显著削弱了细胞中DNA和蛋白质的合成活动。在低温胁迫条件下，某些细菌可合成DnaK和GroEL等冷休克蛋白，二者可与mRNA结合并促进翻译，从而保证自身生物活动的进行[28]。Brinton等对西伯利亚冻土微生物进行研究后发现，微生物可以修复蛋白质，稳定其氨基酸构象[23]。

总的来说，冻融作用会抑制微生物细胞中DNA和蛋白质的合成表达，但为了克服这一现象所带来的危害，某些细胞会启动其他的基因表达方式，促进基因的合成表达，或发挥其蛋白质的稳定修复作用，以克服生存困境。这体现了生物学水平上的进化性，对于生物困境进化的研究具有重要意义。

1.3冻融速率对微生物的影响

关于冻融速率对微生物的影响作用，不同学者观点不同。孙辉等在对冻融试验的设计方法进行研究时发现，许多室内模拟试验利用冰箱控制冻结过程，使土壤温度快速降低到较低温度，这对绝大多数土壤微生物来说是致命的，因为在自然条件下，冻融过程中土壤冻结温度是逐步下降的，在土地表面积雪和植被等的覆盖下，土壤温度下降极其平稳和缓慢，使得微生物有一段适应低温的缓冲时间[7]。但也有学者认为，土壤的快速冻结和融化对微生物的影响较小，而缓慢冻结和融化则对微生物细胞损伤较大[16]。冻结时细胞外部形成冰晶颗粒，冰晶颗粒越大，对细胞器破坏力越强，如果冻结速率很慢，微生物细胞会充分进行脱水，以致细胞内外渗透压失去平衡，破坏细胞壁结构，最后导致细胞破碎死亡[16]。当冻融速率大于1 000 ℃/min时，细胞内水分可在跨膜运输前迅速冻结，避免细胞内外渗透压失去平衡所造成的危害[16]；在融化过程中，如果融化速率足够高，胞内重结晶现象就可以避免，有利于微生物细胞的存活[29]。

1.4冻融强度和频数对微生物的影响

冻融频数对微生物影响明显。1次冻融循环能杀死50%的土壤微生物[30]，并明显减少约33%的土壤DNA含量[25]。多次冻融循环显著降低土壤中可培养微生物数量，减少可培养微生物的多样性[31]。但是，这些经过多次冻融后存活下来的微生物，具有极强的抗冻融能力和生存能力[21]。范志平等对河岸缓冲带土壤的研究结果表明，冻融频数对土壤微生物氮含量有极显著影响（P<0.01） ，冻融温差对土壤微生物氮含量有显著影响[32]。而徐俊俊等关于冻融交替对高寒草地土壤影响的研究结果表明，冻融温度未显著改变土壤微生物氮含量，影响土壤微生物氮含量的主要是冻融频数[33]。熊雪晶对高寒森林土壤微生物的研究结果说明，较温和的冻融会降低土壤真菌数量，而对放线菌数量影响不大；强烈的冻融循环会增加土壤真菌数量，却显著降低土壤放线菌数量[34]。

2土壤环境因子对微生物的间接影响

微生物在土壤中的生存需要适宜的温度、水分、通气条件及营养物质，以此来维持其正常的生命代谢活动。土壤冻融通过影响土壤温度、水分、通气性以及水分物质迁移间接影响微生物的生物量和活性[35]，另外，土壤中死亡微生物也会对残余幸存微生物产生影响[36]。

2.1土壤温度和水分

土壤中大部分营养元素转化过程，尤其是氮素转化都是微生物参与的生物化学过程[37]。冻融作用通过改变土壤环境因子进而影响土壤微生物的数量及活性，其中温度和水分是影响土壤氮素转化的最主要因素[38-40]。温度直接影响氮素生物化学过程，间接影响微生物的耗氧量和土壤好气环境；水分的可利用性直接影响微生物活性，同时通过控制土壤中氧气的扩散间接影响氮素矿化和好氧微生物活性[41]。

2.2通气性

微生物中既有好氧微生物，也有厌氧微生物，所以它们降解转化土壤有机物质的过程可能是好氧的，也可能是厌氧的，这时土壤通气性就显得十分重要[42]。王恩姮等对东北典型黑土的研究结果表明，季节性冻融后，黑土总孔隙度和毛管孔隙度均有不同程度的降低[3]。而邓西民等对壤质黏土犁底层原状土的研究发现，冻融后土壤孔隙度增加6.1%～163%[43]。刘虹等研究认为，在冻融过程中，土壤孔隙度呈现先减小后增大的变化趋势[44]。可见，冻融作用对土壤孔隙度的影响受多因素决定，其结果各不相同。

2.3水分物质的迁移

微生物不仅自身的生命活动离不开水，而且在与外界环境交流反应时更离不开水，微生物只能生活在水溶性的环境中[42]。其中，土壤有效性水分是维持微生物活性的重要资源，它影响着土壤微生物群落生理结构和功能[45]。

土壤冻融过程中常伴随水分的迁移和再分布，温度是导致土壤水分迁移的驱动力[46]。在土壤自上而下的冻结过程中，水分自下而上迁移[46]。土壤的冻结过程会固定大量的水分和底物，降低可利用氧气的含量，形成相对厌氧的环境[47]，促进微生物的异养生长[48-49]。在冻结土壤融化时，由于上层冰雪融化和下层冰冻阻碍水的排放等原因，造成融化后土壤含水量明显提高[50]。此时，土壤孔隙度和氧气减少，有利于微生物获得充足的水分和营养物质，也有利于微生物进行反硝化作用，促进微生物的异养生长[51]。另一方面，冻融作用使土壤水分含量显著提高，养分更容易溶出，或通过各种途径包裹在矿物颗粒或吸附于土壤胶体的表面随水分迁移而流失[36]。

2.4死亡微生物

冻融作用通过低温或干湿交替杀死土壤中的一部分微生物，死亡微生物会释放出营养物质，而残余幸存下来的微生物将死亡微生物作为基质而使自身活性在某种程度上增强[36]，特别在土壤融化时，受冻结作用死亡的微生物细胞及破碎的土壤团粒结构、植物残体，会释放出碳、氮等物质，为残余微生物提供大量的营养物质[52-56]。同时，温度的升高，可利用水分和通气程度的增加也为微生物修复受损细胞及大量生长提供了必要条件[57]。Mecleod等研究发现，土壤冻结能够破坏微生物细胞膜，使胞内物质被释放到土壤中[58]。Goodroad等研究发现，土壤残余微生物有选择性地利用死亡微生物产生基质，这些微生物在冬季仍然很活跃[59-60]。

3冻融对微生物群落结构的影响

土壤微生物群落以细菌数量最多，占土壤微生物数量的70%～90%，放线菌、真菌次之。微生物在土壤中的分布状况与生物化学活性，一方面反映了土壤因子对微生物的影响和作用；同时显著影响土壤肥力、植物生长发育与土壤改良状况，揭示着土壤发育的演变规律[61]。

冻融作用可以强烈影响微生物活性和微生物群落组成[52，62-65]。以细菌种群为例，刘利对川西亚高山/高山森林群落土壤的研究结果表明，在季节性土壤冻结过程中，细菌类群数量明显降低，细菌类群的丰富度及多样性也显著降低，温度的急剧下降改变了土壤细菌群落的结构[66]。主要原因是：一方面不耐低温的细菌类群可能在冻结过程中死亡，另一方面耐受低温型的细菌类群得以存活，并保持一定的活性[59-60，67]。而在整个微生物群落中，冻融循环能够改变微生物的代谢群落，夏季以细菌为主，冬季则转以真菌为主[56，68]。王怀玉等对亚高山冷杉林土壤微生物的研究发现，经过1个季节性冻融后，土壤细菌和放线菌数量显著减少，真菌数量明显增加，同时，土壤真菌/细菌比值有所增加[69]。这是因为真菌较细菌对低温的抗性更强[70]，一方面真菌可以依靠其发达的菌丝系统利用更广范围的资源以调节胞内环境，从而更能适应土壤水热状态的改变，另一方面冻融循环可能通过其机械作用促使菌丝体分化，增加真菌数量，相关研究还需要进一步深入[71]。但也有一些研究持不同观点，例如，Staricka等对极地苔原微生物的研究发现，在多次单日尺度（白天2 ℃，9 h；晚上-4 ℃，15 h，18个循环）冻融循环后，微生物C/N的值降低，表明微生物群落优势种从真菌逐渐转向细菌[72]；Schimel等根据TGGE分析方法，得出冻融循环对土壤微生物群落结构没有影响[73]；Beare也认为，冻融变化有时并不会引起土壤细菌和真菌丰富度的变化[74]。

4冻融对微生物量的影响

土壤微生物量是活体微生物的生物量，是活体微生物数量的直接体现[75]。在整个冻融循环期间，微生物量的变化可能经过以下阶段：（1）冻融初期，低温直接杀死相当部分土壤微生物，导致土壤微生物量下降[76-77]，Mikan等研究发现，当土壤温度降到-10 ℃以下时，微生物量迅速下降[78]。但微生物量不会随着冻结持续下降，因为存活下来的微生物特别是低温嗜冷微生物[79]，从土壤团粒、植物根系和凋落物以及死亡微生物释放的养分中得到有效基质，以维持其生存[10]。（2）土壤融化初期，微生物量急剧增加，这是由于土壤融化时释放出冻结期积累养分，增加土壤中的有效基质，从而激发微生物的快速生长繁殖[75-76]。（3）但是，这种微生物的增加不会持久。一方面，随着融化过程中的淋溶流失和复苏植物的吸收利用，土壤中的有效基质被快速消耗，限制微生物量的持续增加[80-81]。另一方面，自然环境中雪被融化导致土壤含水量剧烈变化，微生物细胞内水分和土壤自有水之间的水势失衡可能导致微生物细胞死亡，又降低土壤中的微生物量[76]。

Schimel等研究认为，冻融交替使微生物死亡，降低土壤中微生物数量[73]。Walker等认为，在最初几个冻融循环中，土壤微生物中氮含量显著下降，随后有所升高[31]。杨思忠等认为，变温幅度稍大的冻融循环可显著降低微生物数量，但冻融循环过程释放的养分也利于微生物生长，使微生物数量增加[21]。而Grogan等研究发现，冻融对土壤微生物量没有显著影响或影响不大[55-56]，这与Koponen等的研究结果[79]一致。可见，冻融循环对土壤微生物量影响的研究结果还具有很多不确定性，亟待深入研究。

5展望

微生物是土壤生态系统中极其重要和最为活跃的部分，是地上和地下生态系统联系的纽带和桥梁，在土壤养分循环、系统稳定性、抗干扰能力以及可持续利用中占主导地位，控制着土壤生态系统功能的关键过程[82-83]。由于其生长繁殖迅速，环境适应性强，对水热条件和气候等自然条件的变化反应敏感，所以研究冻融作用对微生物的影响可以反映出多方面的问题。从微观方向来看，微生物在分子细胞、基因蛋白质等水平上对低温冻结或冻融作用的反映机理，一方面代表了生命对于环境的极限适应能力，有助于深入探讨生物在逆境中的进化问题，另一方面也从内部解释了微生物在冻融条件下的死亡、休眠以及生理生化功能的改变。从宏观方向来看，目前全球变暖已经成为不争的事实[84]，由此引起的季节性冻融变化必然直接或间接作用于生态系统地下/地上部分，而这些直接或间接的作用大多数都是通过微生物的活动进行的。尽管已有许多研究结果证明了冻融对土壤微生物的影响[52，62-65]，但也有研究持不同的观点[56，65，85]。这可能是由于试验控制技术很难模拟自然环境，也可能由于地域环境条件不同，还有可能是微生物自身类群不同而导致的差异，其具体原因及反应机理都有待进一步研究。

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