包头尾矿库区不同分子量和种类腐殖酸的提取及表征

施和平++吴瑞凤++张静茹++石磊++李金英

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.130

摘要：采用焦磷酸钠萃取法提取腐殖酸，并分离得到黄腐酸、棕腐酸和黑腐酸，通过膜分离技术分离腐殖酸得到6种不同分子量的腐殖酸。对样品用元素分析、红外光谱、紫外分析及荧光光谱法进行了表征。结果表明，各种腐殖酸的化学组成有相似之处，但在结构上有明显不同：（1）元素分析发现不同腐殖酸之间H/C、C/N原子比具有明显的差异，不同分子量的腐殖酸，分子量越大芳香度越高；而3种不同类型的腐殖酸中，芳香度为黑腐酸>棕腐酸>黄腐酸。不同分子量腐殖酸中分子量越小的腐殖化程度越高，而不同类型的腐殖酸中黄腐酸腐殖化程度最高。（2）荧光谱图表明不同腐殖酸中分子量越小荧光强度越强，黑腐酸、棕腐酸明显强于黄腐酸；说明不同腐殖酸的结构存在差异。（3）紫外分析显示，各种腐殖酸均含有芳香官能团，用E4/E6解释腐殖酸的芳香缩合程度发现与元素分析所得结论一致。（4）红外光谱也得出不同腐殖酸结构和特性存在相似性和差异性，均含有羧基，除黄腐酸与分子量小于10 000的腐殖酸外均含有芳环或酚类。

关键词：腐殖酸；提取；表征；包头尾矿库区

中图分类号： X132；O657文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0451-04

收稿日期：2015-08-18

基金项目：国家自然科学基金（编号：21167010）。

作者简介：施和平（1970—），男，山西朔州人，博士，副教授，研究方向为环境化学。E-mail：hpshi2002@163.com。腐殖酸（humic acids，HA）是一种分子结构相似、组成复杂的天然有机化合物，广泛存在于土壤、水体及沉积物中[1-4]。 在土壤中腐殖质约占有机质总量的85%～90%，是土壤有机质的主要组成部分。不同来源的腐殖酸，其化学组成、结构和性质有差异性[5]，研究表明腐殖酸的元素组成有C、H、O、N及少量的P、S，在泥炭和煤中，氮含量较低，碳含量较高；而土壤腐殖酸的碳和氮含量都较高，而且不同地区和种类的腐殖酸含有的羟基、羧基、醌基、羰基和甲氧基等活性官能团也不相同，这些性质和结构的差异将明显地影响腐殖酸在环境地球化学和区域碳循环中的作用[6-7]。腐殖酸可以吸附络合土壤和水体中的重金属、放射性核素等污染物，因此研究污染物在土壤和水体中的迁移、转化等行为，必须首先明确不同地区土壤和水体中腐殖酸的化学组成、性质和结构，明确其对放射性核素等的吸附络合行为。

本研究提取了包头尾矿地区土壤中的腐殖酸，并对其进行了分类，得到黄腐酸、棕腐酸和黑腐酸，同时利用膜分离技术对提取得到的腐殖酸进行分子量分离，得到6种不同分子量的腐殖酸，并分析其化学组成和结构，明确不同种类和不同分子量的腐殖酸的差异性。试验结果将对重金属、放射性核素的迁移转化研究有重要的意义，可明确腐殖酸对重金属、放射性核素的吸附络合作用。

1材料与方法

1.1试验试剂和仪器

试剂：Na2P2O7，NaOH，KOH，HCl，HF，无水乙醇。

仪器：低速离心机：80-2，常州国华电器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，郑州英峪予华仪器有限公司；SCM杯式超滤器：上海斯纳普膜分离科技有限公司；电热鼓风干燥箱：SY101BS-D，天津三水科学仪器有限公司；元素分析仪：VARIOELⅢ型，德国Elementar公司；荧光分析仪：CaryEclipe，美国瓦里安公司；紫外光谱仪：UV-1800，上海美谱达仪器有限公司；傅立叶红外光谱仪：Nexus670，美国 Nicolette 公司。

1.2腐殖酸的提取和分离[8]

腐殖酸提取采用焦磷酸钠法；不同种类腐殖酸的分离采用氢氧化钠法得到棕腐酸、黑腐酸和黄腐酸；不同分子量腐殖酸的分离采用加压超滤法，使用不同分子量截留的超滤膜进行分离，得到6种不同分子量的腐殖酸，即分子量<4 000、4 000～10 000、>10 000～30 000、>30 000～50 000、>50 000～70 000 、>70 000的腐殖酸。

1.3腐殖酸的表征

对得到的10种腐殖酸分别用元素分析、荧光分析（实验条件：发射光波长295 nm，扫描范围350～570 nm）、紫外分析（扫描范围800～200 nm）和红外分析（扫描范围：4 000 ～400 cm-1）进行了表征。

2结果与讨论

2.1元素分析

10种不同种类和不同分子量的腐殖酸元素分析结果见表1。不同种类腐殖酸C、H、N元素含量有很大的差异，其中黑腐酸含C、H量最大，黄腐酸含C、H量最小；不同分子量中小于4 000的含C量最小，含C和H量基本随分子量的增加而增大，说明不同种类和不同分子量腐殖酸的组成和结构有差异性。

腐殖酸的H/C和C/N等原子比可用来鉴别腐殖酸的来源和结构的差异性。H/C值可用于推测腐殖酸的芳香度和脂肪度[9-13]，H/C值小表明其芳香度高（不饱和程度高），H/C 值大则表明其脂肪化程度高（饱和程度高）。黄腐酸的H/C值最大，黑腐酸和棕腐酸的值较小，由此可见芳香度从大到小为黑腐酸>棕腐酸>黄腐酸，而脂肪度正好相反；不同分子量腐殖酸中，分子量小的H/C值最大，随着分子量的增加H/C值逐渐减小，当分子量超过30 000，H/C值变化不大，说明分子量小的腐殖酸的脂肪化程度高（饱和程度高），而分子量大的腐殖酸的芳香度大（不饱和程度高）。腐殖酸的 C/N 值可表示腐殖酸的腐殖化度，C/N值越低，其腐殖化程度越高[11]。黄腐殖酸的C/N值特别小，其余2种腐殖酸C/N 值均大于30，表明黄腐酸的腐殖化程度最高；不同分子量腐殖酸中，分子量小于4 000的C/N值最低，说明腐殖化程度最高，大于 70 000 的C/N值最大，腐殖化程度最低，其余的 C/N 值相差不大，腐殖化程度差别不大。

2.2紫外分析

各种腐殖酸的紫外吸收谱图见图1、图2。由图1、图2可知，各种腐殖酸有较强的紫外吸收强度，说明均含有芳香族CC键及其他生色团，其吸收随波长的增加而逐渐减少，是一个混合紫外吸收光谱，且不同分子量的腐殖酸紫外吸收强度随分子量增加而增加，说明分子量越大其缩合度也越大。除分子量小于4 000、大于70 000的和黄腐酸外，其余的腐殖酸均在 230 nm 处有1个吸收峰，说明含有取代的芳烃羧基或酚基结构[14-16]。分子量越大的腐殖酸吸收强度越大，且在可见区域也有吸收，这可能是由于大分子物质在可见区域产生的吸收所致。腐殖酸在285 nm处的紫外特征吸收峰可用来表征芳香度，285 nm处的紫外吸收值越高表明腐殖酸的芳香度越大，芳香族基团含量越高[17-18]，不同分子量的285 nm处的紫外吸收值随分子量的增大而增加，说明芳香度随分子量的增加而增大；不同种类腐殖酸中黑腐酸的285 nm处的紫外吸收值大于棕腐酸，棕腐酸大于黄腐酸，说明其芳香度从大到小为黑腐酸>棕腐酸>黄腐酸，这与元素分析得到的结论完全一致。

特定波长的E4/E6（E465/E665）是腐殖酸的一个特征常数，其值可以反映分子中芳香环的缩合度和芳构化度。由表

2中数据可知，分子量越大的腐殖酸E4/E6值越小，说明其芳香度越高；不同种类腐殖酸中黑腐酸的芳香度最高，这与前面元素分析得到的结论完全一致。

2.3红外分析

10种不同腐殖酸的红外图谱见图3和图4。由图3、图4可见，各种腐殖酸均在3 500～2 500 cm-1处出现强而宽的缔合-OH吸收峰，3 000～2 800 cm-1处出现脂肪C—H伸缩振动吸收峰，1 720 cm-1附近出现羧基及羰基—CO的振动吸收峰，1 620 cm-1 附近出现芳环骨架—CC振动吸收峰，氢键缔合CO吸收和酞胺键等相互叠加吸收峰；1 400 cm-1处出现羧酸或醇类的O—H弯曲振动及酚类的C—O伸缩振动峰，1 250 cm-1处出现羧基的C—O伸缩振动和O—H的变形振动，1 040 cm-1处有C—O—C的含氧结构特征吸收峰，表明不同种类和不同分子量腐殖酸中都有类似的结构[19-20]。但分子量大于10 000的腐殖酸和黑腐酸在700～900 cm-1处有苯环吸收峰；分子量小于4 000和4 000～10 000的腐殖酸以及黄腐酸在970 cm-1附近出现1个强峰，可认为是与烯烃相连的C—H面外变形振动峰，另外在500 cm-1处出现1个

强的吸收峰，可能是卤族元素C—X伸缩振动峰，与其他腐殖酸的结构存在差异性。

2.4荧光分析

10种不同种类腐殖酸的荧光光谱图见图5、图6。不同分子量的荧光强度与腐殖酸的分子量组成和芳香度等密切相关，是描述腐殖酸结构的特征参数，由图5可见，在相同波长下，不同分子量腐殖酸均在350～550 nm有强烈吸收峰，表明其结构组成具有相似性，由于腐殖酸是含有许多荧光基团的复杂混合物，所以得到宽而无特征的荧光峰。3种不同腐殖酸中，棕腐酸吸收强度最大，黑腐酸次之，黄腐酸最弱（图6）。Sierra等认为腐殖酸中，在低激发波长小于250 nm处荧光峰应由芳环酚类物质所贡献[21]。不同分子量腐殖酸荧光吸收强度随分子量的增加而逐渐减小，且最大峰值逐渐右移，Miano等研究表明，分子量小、芳香度低的有机质组分荧光强度高于分子量大、芳香度高的有机质组分[22-23]，本试验结果与之完全一致，元素分析和紫外分析得到的结果也与之相对应。

3结论

包头尾矿库区提取得到的腐殖酸中黑腐酸占4213%，棕腐酸占12.46%，黄腐酸占45.41%；不同分子量的腐殖酸中，分子量<4 000的占4%，4 000～10 000的占4.7%，>10 000～30 000的占1.3%， >30 000～50 000的占9%，>50 000～70 000的占20%， >70 000的占61%， 说明该地区腐殖酸主要以黑腐酸和黄腐酸为主，而从分子量分布来看，主要是分子量大于50 000的腐殖酸。元素分析发现黑腐酸的含C、H量最大，黄腐酸的含C、H量最小；不同分子量腐殖酸中小于4 000的含C量最小，含C和H量基本随分子量的增加而增大，说明不同种类和不同分子量腐殖酸的组成和结构有差异性。

对得到的各种腐殖酸表征发现不同种类腐殖酸的芳香度为黑腐酸>棕腐酸>黄腐酸，不同分子量的腐殖酸的芳香度随分子量的增大而增加；而不同种类腐殖酸中黄腐酸的腐殖化程度最高，不同分子量腐殖酸中分子量小于4 000的腐殖化度最高。

对各种腐殖酸表征发现具有相似的结构特征，所有的腐殖酸均含有羧基，除黄腐酸和分子量小于10 000的腐殖酸外，其余的均含有芳环或酚类结构官能团；各种腐殖酸的紫外和荧光吸收均是一个混合吸收峰，随分子量的增加而逐渐变小并右移，说明它们的结构具有一定的差异性。而结构的差异性对于其在环境中吸附络合重金属等污染物的行为有着巨大的影响，有待于进一步研究腐殖酸结构和吸附络合重金属的相关性。

参考文献：

[1]Kang K H，Shin H S，Park H. Characterization of humic substances present in landfill leachates with different landfill ages and its implications[J]. Water Research，2002，36（16）：4023-4032.

[2]Klavins M，Apsite E. Sedimentary humic substances from lakes in Latvia[J]. Environment International，1997，23（6）：783-790.

[3]Fooken U，Liebezeit G. Distinction of marine and terrestrial origin of humic acids in North Sea surface sediments by absorption spectroscopy[J]. Marine Geology，2000，164（3）：173-181.

[4]Alborzfar M，Jonsson G，Gran C. Removal of natural organic matter from two types of humic ground waters by nanofiltration[J]. Water Research，1998，32（10）：2983-2994.

[5]张盛华，郑凯琪，薛红波，等. 城市污泥堆肥过程中腐殖酸及重金属形态的变化[J]. 江苏农业学报，2014，30（6）：1350-1354.

[6]国家环境保护总局. 水和废水检测分析方法 [M]. 4版. 北京：中国环境科学出版社，2002.

[7]Gbbels F J，Püttmann W. Structural investigation of isolated aquatic fulvic and humic acids in seepage water of waste deposits by pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry[J]. Water Research，1997，31（7）：1609-1618.

[8]李善祥. 腐殖酸产品分析及标准[M]. 北京：北京工业出版社，2007.

[9]Rice J A，MacCarthy P. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances[J]. Organic Geochemistry，1991，17（5）：635-648.

[10]Gonzalez-Vila F J，Martin F，Del Rio J C，et al. Structural characteristics and geochemical significance of humic acids isolated from three Spanish lignite deposits[J]. Science of the Total Environment，1992，117：335-343.

[11]Aiken G R，McKnight D M，Wershaw R L，et al. Humic substances in soil，sediment，and water：geochemistry，isolation and characterization[M]. New York ：Wiley，1985.

[12]Hargitai L. Biochemical of elemental characteristics of humic substances during humification related to their environmental functions[J]. Environmental International，1994（20）：43-48.

[13]Kim J I，Buckau G，Li G H，et al. Characterization of humic and fulvic acids from Gorleben groundwater[J]. Fresenius Journal of Analytical Chemistry，1990，338（3）：245-252.

[14]何海军，翟文川，钱君龙，等. 湖泊沉积物中腐殖酸的紫外-可见分光光度法测定[J]. 分析测试技术与仪器，1996，2（1）：14-18.

[15]Thomsen M，Lassen P，Dobel S，et al. Characterisation of humic materials of different origin：a multivariate approach for quantifying the latent properties of dissolved organic matter[J]. Chemosphere，2002，49（10）：1327-1337.

[16]Chen J，Gu B，LeBoeuf E J，et al. Spectroscopic characterization of the structural and functional properties of natural organic matter fractions[J]. Chemosphere，2002，48（1）：59-68.

[17]Veeken A，Nierop K，De Wilde V，et al. Characterisation of NaOH-extracted humic acids during composting of a biowaste[J]. Bioresource Technology，2000，72（1）：33-41.

[18]Kalbitz K，Geyer S，Geyer W. A comparative characterization of dissolved organic matter by means of original aqueous samples and isolated humic substances[J]. Chemosphere，2000，40（12）：1305-1312.

[19]张玉兰，孙彩霞，陈振华，等. 红外光谱法测定肥料施用26年土壤的腐殖质组成特征[J]. 光谱学与光谱分析，2010，30（5）：1210-1213.

[20]傅平青，吴丰昌，刘丛强，等. 高原湖泊溶解有机质的三维荧光光谱特性[J]. 海洋与湖沼，2007，38（6）：512-520.

[21]Sierra M M D，Giovanela M，Parlanti E，et al. Fluorescence fingerprint of fulvic and humic acids from varied origins as viewed by single-scan and excitation/emission matrix techniques[J]. Chemosphere，2005，58（6）：715-733.

[22]Miano T M，Martin J P，Sposito G. Flourescence spectroscopy of humic substances[J]. Soil Science Society of America Journal，1988，52（4）：1016-1019.

[23]Senesi N. Molecular and quantitative aspects of the chemistry of fulvic acid and its interactions with metal ions and organic chemicals：Part Ⅱ. The fluorescence spectroscopy approach[J]. Analytica Chimica Acta，1990，232：77-106.