1株产蓝色素链霉菌发酵条件的优化

左勇++江鹏+++叶碧霞++王小龙++傅彬++杨小龙++张晶

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.131

摘要：研究了1株产蓝色素的链霉菌D2013的发酵条件。在单因素试验（发酵温度、发酵时间、接种量、起始pH值、装液量等因素）的基础上，以正交试验优化发酵条件。结果表明，链霉菌D2013产蓝色素的最优发酵条件为：发酵时间8 d、发酵温度30 ℃、接种量8%、装液量100 mL/250 mL、起始pH值为7.6，在此条件下，蓝色素的产量可达 74.8 U/mL。

关键词：链霉菌；蓝色素；发酵；正交试验

中图分类号： TQ920.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0455-03

收稿日期：2015-08-17

基金项目：四川省教育厅成果转化项目（编号：11ZZ016）。

作者简介：左勇（1972—），男，重庆万州人，硕士，教授，主要从事食品工程方面的研究。E-mail：sgzuoyong@tom.com。目前，随着合成色素在食品和化妆品等领域引起的安全问题不断被报道，以及对合成色素毒性认识的不断加深，许多合成色素已被禁止用于食品、化妆品等领域，使得相关企业不得不寻求无毒或低毒的色素代替 “有毒色素”的应用。

天然色素具有无毒、无害及对人体有益等优点[1]，将逐步取代合成色素的应用。现在，市场对天然色素的需求逐渐增大，如何获得大量的天然色素以满足市场需求已成为色素领域的研究热点。微生物色素作为一种天然色素，不仅具有天然色素的着色功能，大多数微生物色素还具有保健价值和药用价值[2-7]。另外，微生物色素的生产不受资源、季节等的限制，制取工艺简单，成本相对较低，必将成为天然色素的主要来源之一。目前，利用微生物生产的天然色素种类较多、色系较齐[8-10]，但通过发酵法生产的天然蓝色素却十分罕见[11-12]，因此研究微生物发酵产蓝色素有重要的研究价值和现实意义。

本试验以链霉菌D2013为试验菌株，通过单因素试验和正交试验对其产蓝色素的发酵条件进行研究，以期为进一步开发该菌株产蓝色素提供基础研究。

1材料与方法

1.1菌种与培养基

1.1.1菌种链霉菌D2013，来源于四川理工学院生物工程学院实验室。

1.1.2种子培养基和发酵培养基均采用高氏1号液体培养基[13]。

1.2主要仪器与设备

SKY-2102C恒温培养振荡器（上海苏坤实业有限公司），GZ-250-HSⅡ恒温恒湿培养箱（韶关市广智科技设备有限公司），UV759S紫外可见光分光光度计（上海宜有电子科技有限公司）。

1.3种子的制备

挑取适量链霉菌D2013孢子，接种于种子培养基中，30 ℃、200 r/min，培养24 h后，作为种子。

1.4蓝色素产量的测定方法[12]

（1）蓝色素相对效价单位定义：1 mL发酵液所提取的蓝色素，在pH值为9.0及在576 nm的波长下测定吸光度，将D值0.1定义为1个色素效价相对单位（U/mL），简称色价。

（2）蓝色素产量的测定方法：将发酵液以8 000 r/min离心10 min后取上清。调pH值至9.0，再用pH值为9.0的水溶液定容至原发酵体积，测定D576 nm值，计算色价。本研究所测色素为胞外蓝色素。

1.5发酵条件的研究[14-17]

本试验以高氏1号培养基作为发酵培养基。通过单因素试验，研究发酵时间、发酵温度、装液量、接种量和发酵起始pH值等因素对D2013产蓝色素的影响，在单因素试验的基础上，采用正交试验对发酵条件进行优化。

2结果与分析

2.1发酵温度对D2013产蓝色素的影响

在接种量为10%、发酵起始pH值为7.2、发酵时间为 9 d、装液量为100 mL/250 mL的条件下，发酵温度分别控制为 21、24、27、30、33、36、39 ℃，进行发酵试验，结果见图1。

由图1可知，发酵温度在21～30 ℃内，蓝色素的产量随着温度的升高而增加；当发酵温度为30 ℃时，蓝色素的产量最高；发酵温度超过30 ℃后，蓝色素的产量明显下降。原因可能是温度不但影响链霉菌的生长和代谢途径，同时还可能影响发酵培养基的理化性质（营养浓度、pH值等）及所产蓝色素的稳定性，故发酵的最适温度为30 ℃。

2.2发酵时间对D2013产蓝色素的影响

在发酵温度为30 ℃、发酵起始pH值为7.2、接种量为10%、装液量为100 mL/250 mL的条件下，发酵时间分别控制为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，进行摇瓶发酵，结果见图2。

由图2可知，发酵时间在2～8 d内，蓝色素的产量随着发酵时间的增加而增加；当发酵时间为8 d时，蓝色素的产量最高；发酵时间超过8 d后，蓝色素的产量不但没有增加，反而有下降的趋势。原因在于发酵的前期，蓝色素的产量与链霉菌生长有关，随着发酵时间的增加蓝色素的产量不断增加；随着发酵时间的延长，在发酵的后期，由于营养物质的大量消耗，菌体不再产蓝色素，代谢产生的蓝色素可能在自身酶的作用下发生降解或转变为其他物质，从而使蓝色素产量减少，故最适发酵时间确定为8 d。

2.3接种量对D2013产蓝色素的影响

在发酵温度为30 ℃、发酵起始pH值为7.2、发酵时间为9 d、装液量为100 mL/250 mL的条件下，接种量分别控制为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%进行发酵试验，结果见图3。

由图3可知，接种量在2%～8%内，蓝色素的产量随着接种量的增大而增加；当接种量为8%时，蓝色素的产量最高；接种量超过8%后蓝色素的产量显著下降。原因在于，接种量的大小将决定微生物的生长繁殖速度，会影响代谢产物的生成[15]；接种量过小，菌体的调整期长，发酵周期延长，影响发酵效率；接种量过大，营养物质消耗快，培养液的理化因子变化快，不利于蓝色素产生，故最适接种量应为8%。

2.4装液量对D2013产蓝色素的影响

在250 mL的摇瓶中，装液量分别为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mL的条件下，接种量控制为10%、发酵温度为30 ℃、发酵起始pH值为7.2、发酵时间9 d，进行摇瓶发酵试验，结果见图4。

由图4可知，装液量在20～100 mL内，蓝色素的产量随着装液量的增加而增加；当摇瓶装液量为100 mL时，蓝色素的产量最高；装液量超过100 mL后，蓝色素的产量有下降的趋势。这是由于装液量少，营养物质含量少、发酵容积小，影响了蓝色素的产量；然而随着装液量的增加，溶氧量减小，不利于蓝色素的产生；故在250 mL的摇瓶中，发酵的最佳装液量为100 mL。

2.5发酵起始pH值对D2013产蓝色素的影响

在接种量为10%、发酵温度为30 ℃、发酵时间为9 d、装液量为100 mL/250 mL的条件下，将发酵起始 pH值 分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2进行发酵试验，结果见图5。

由图5可知，发酵起始pH值在5.0～7.6内，蓝色素产量随pH值增大而增加；当pH值为7.6时，蓝色素的产量最高；pH值超过7.6后，蓝色素的产量明显下降。这是由于pH值不仅可以影响链霉菌的生长，还可能影响蓝色素的稳定性；pH值会影响菌株代谢所需酶的活性，pH值过低或过高都不利于菌体生长，从而影响蓝色素的产量，故发酵的最适起始pH值为7.6。

2.6正交试验

在单因素研究结果基础上，按表1安排5因素4水平的正交试验[18]，优化发酵条件。

由表2可知，5个因素对D2013产蓝色素的影响的主次为D>C>B>A>E，即装液量的影响最大，接种量和发酵温度的影响次之，发酵时间和起始pH值的影响较小。由表3可知，因素C和D在统计学上有显著影响，而因素A、B和E没有显著影响。综合直观分析和方差分析的结果可知，发酵条件的最佳组合为A2B2C2D3E2，即控制摇床转速为 200 r/min 时，最优发酵条件为：发酵时间8 d、发酵温度 30 ℃、接种量8%、装液量100 mL/250 mL以及发酵起始pH值为76，此条件下蓝色素的产量最高。

2.7验证试验

由正交优化试验结果得知最优发酵条件的组合不在16个试验内，该发酵条件是否是真正最优，还需做实际验证试验。按最优组合进行验证试验，结果见表4。

由表4可知，正交优化后蓝色素最低产量为74.4 U/mL，蓝色素最高产量为75.1 U/mL；蓝色素的平均产量为 74.8 U/mL，与正交试验结果中的最高产量73.1 U/mL在统计学上没有差异，由此可知正交优化的试验结果可以作为链霉菌D2013产蓝色素的最佳发酵条件，与优化前（56.1 U/mL）比较，蓝色素的产量提高了33.3%。

3结论

本试验通过单因素试验确定了发酵温度、发酵时间、装液量、接种量、发酵起始pH值对链霉菌D2013产蓝色素的影响，在单因素试验的基础上，以正交试验优化了链霉菌D2013的发酵条件。链霉菌D2013在固定的摇床转速（200 r/min）下最优发酵条件为：发酵时间8 d、发酵温度 30 ℃、接种量8%、装液量100 mL/250 mL、发酵起始pH值7.6，蓝色素的平均产量达到74.8 U/mL。

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