1株高产IAA菌株的筛选、鉴定及对白菜的促生作用

邢芳芳++高明夫++胡兆平++李新柱

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.132

摘要：从番茄根际采集的土壤中分离筛选得到12株产IAA的菌株，经复筛获得1株具有较好IAA生产能力的细菌，其发酵24 h产IAA水平达到48 mg/L以上，将其命名为HB-1。通过对菌株HB-1的16S rDNA序列分析对该菌进行鉴定，并将菌株HB-1进行液体发酵扩繁，将得到的发酵液冲施白菜，试验其促生作用。结果表明，该高产IAA菌株为枯草芽孢杆菌。盆栽试验结果表明，菌株HB-1对白菜生长具有明显的促生作用，施加HB-1发酵液处理的叶绿素含量、叶片数均高于对照（CK）；HB-1发酵液处理的鲜质量、干质量与冲施清水的CK相比都增加，鲜质量增加 1.54～17.98 g，增幅达1.16%～13.55%，差异达到显著水平，干质量增加0.26～1.32 g，增幅达到2.97%～1492%。其中添加发酵液1.0 mL/盆的处理组效果较好，叶绿素含量比CK高5.02%，叶片数比CK高15.78%，鲜质量较空白处理增加 17.98 g，增幅达13.55%，差异达极显著水平，干质量平均增加1.32 g，增幅达到14.92%。

关键词：IAA；筛选；鉴定；枯草芽孢杆菌；促生作用

中图分类号：S144文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）09-0458-03

收稿日期：2015-09-14

基金项目：山东省科技重大专项（新兴产业）（编号：2015ZDXX0502B02）。

作者简介：邢芳芳（1982—），女，山东临沂人，硕士研究生，工程师，主要从事新型肥料研发及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：xingfangfang@kingenta.com。

通信作者：李新柱，博士研究生，工程师，主要从事新型肥料研发及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：lixinzhu@kingenta.com。植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，简称PGPR）是指能够通过分泌有益物质直接或间接促进植物生长的细菌[1]。产生植物激素是根际促生细菌与植物相互作用的主要机制之一。吲哚乙酸（indole 3 aceticacid，简称IAA）是产生调节植物生长素的信号物质，是在植物体内普遍存在的生长素物质[2]。自1977年科学家发现巴西固氮螺菌能合成IAA后，更多研究发现，土壤中约50%以上的细菌可以产生IAA[3]。筛选具有产生IAA的微生物可为促生生物肥料的研发等提供出发菌株。

本研究对番茄根际产IAA菌株进行分离、鉴定及盆栽促生效果研究，以期为开发高效根际促生菌剂、生物肥料资源提供生物学支撑。

1材料与方法

1.1土壤样品

在山东省寿光市采集同一区域内生长情况良好的番茄根际范围的土壤。采样过程中，首先剥离土壤表面覆盖的凋落物，然后剔除石块等杂物，最后使用灭菌采样铲采集10～20 cm 深的土壤样品装于灭菌袋中，带回实验室后置于4 ℃冰箱保存，及时分离。

1.2培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g琼脂，加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值为7.0～7.2，10 000 Pa灭菌30 min。

LB液体培养基[4]：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g NaCl，pH值7.4，灭菌后用细菌过滤器加入L-色氨酸至浓度100 mg/L。

1.3仪器和试剂

主要仪器：Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Therom Fisher）、紫外检测器VWD-3100（美国Therom Fisher）、恒温振荡摇床ZHTY-70（上海知楚仪器有限公司）、电热恒温培养箱BPX-272（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

主要试剂：Salkowski显色液[5]，50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3；IAA标准品；Sigma公司提供的HPLC试剂。

1.4菌株的分离

称取土壤样品10 g，加入带玻璃珠并装有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，振荡20 min，静置10 min形成浓度为 0.1 g/mL 菌悬液，对此菌悬液进行稀释，依次得到10-2、10-3、10-4 g/mL等浓度的菌悬液。用稀释平板法在牛肉膏蛋白胨培养基中分离其中的细菌，将分离所得菌株经过纯化转接到牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.5产IAA菌株的筛选

1.5.1产IAA菌株的初筛将分离纯化后的菌株接种于L-色氨酸浓度为100 mg/L的LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min 条件下摇床培养24 h。取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等量Salkowski显色液进行显色反应，以加入50 μL培养基作为阴性对照。白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30 min后观察，颜色变红者表示能够产IAA。颜色越深，表示分泌的量越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。

1.5.2定量复筛

1.5.2.1IAA标准液及标准曲线的制备标准液的制备：准确称取IAA（精确至0.001 mg）用流动相定容，并进行超声处理数秒钟使其充分溶解，转移到棕色试剂瓶中，置于4 ℃冰箱备用。

制备具有一定浓度梯度的不同IAA溶液，按照所选择的色谱条件进样20 μL，获得不同浓度时IAA的峰面积。根据峰面积（y）和对应的IAA标准品浓度（x，mg/kg）绘制标准曲线，并得出线性方程、相关系数。

1.5.2.2菌液中IAA浓度的测定活化待测菌株，接种于LB液体培养基中，培养24 h后取出，8 000 r/min离心 15 min，然后取各上清液过微孔滤膜，待仪器稳定后，用微量进样器进样，进样量为20 μL。根据标样中各组分的保留时间确定样品中的IAA组分，并根据峰面积计算IAA含量。

1.6产IAA菌株白菜盆栽试验

1.6.1试验时间、地点试验于2015年1—3月在山东金正大生态工程集团股份有限公司研发中心的智能玻璃温室中进行。

1.6.2试验材料供试白菜（Brassica campestris L.）品种为苏州青，种子由山东昌邑市蔬菜研究所提供；供试底肥为氮 ∶磷 ∶钾=15 ∶15 ∶15的硝基复混肥；供试土壤为棕壤，有机质含量12.3 g/kg。

1.6.3试验设计试验共5个处理（表1），每个处理4盆，每盆装土5 kg，硝基复混肥作为底肥1次性施入土壤，每盆施入1.33 g。白菜2叶1心时间苗，每盆保留生长一致、均匀分布的4株作为试验株，管理措施一致。空白组接种清水为对照（CK1），处理组接种菌株的发酵液（108 CFU/mL）。处理1在盆栽中接种0.5 mL灭活菌株发酵液（T1），处理2接种 0.5 mL 未灭活菌株发酵液（T2），处理3在盆栽中接种 1.0 mL 灭活菌株发酵液（T3），处理4接种1.0 mL未灭活菌株发酵液（T4）。每组设4个重复试验，重复接种2次，间隔为15 d，其间适时定量浇水，试验周期58 d。收获时测定叶片SPAD值、叶片数和鲜质量、干质量[6-7]。

1.6.4叶片数、生理指标测定叶片数的统计只选择绿色可食用部分；SAPD值测定采用SPAD-502Plus型叶绿素仪；干质量测定按常规方法进行[8]。

1.6.5数据分析试验数据采用Excel进行处理，利用SPSS 16.0软件进行数据统计及差异显著性分析。

1.716SrDNA序列分析鉴定

IAA产生细菌16S rDNA PCR扩增参考谢永丽等的方法[9]。将16S rDNA扩增产物回收纯化后测序，测序所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对。

2结果与分析

2.1产IAA细菌的分离和筛选

分离纯化得到细菌共计38株，初筛12株产IAA的菌株，经过定性初筛和定量复筛，获得1株具有较好的产IAA能力的细菌，其发酵24 h产IAA水平达到48 mg/L以上，将其命名为HB-1。

2.2菌株HB-1的室内促生试验

2.2.1菌株HB-1对白菜叶绿素含量、叶片数的影响从图1看出，在SPAD值上，各菌剂处理均高于CK，最高的是T4处理，比CK高5.02%，且差异极显著（P<0.01），其次是T2处理，比CK高2.97%，差异明显。从叶片数来看，各处理均高于CK，且差异明显，其中T4处理比CK高15.78%，且差异极显著（P<0.01）。

2.2.2菌株HB-1对白菜鲜质量、干质量的影响图2显示，所有菌剂处理的鲜质量、干质量较冲施清水的对照（CK）相比都增加，与CK相比，添加HB-1发酵液的各个处理鲜质量增加1.54～17.98 g，增幅达到1.16%～13.55%，差异达到显著水平，其中施加1.0 mL/盆等体积发酵液较灭活发酵液鲜质量增加11%；添加HB-1发酵液的各个处理干质量增加0.26～1.32 g，增幅达到2.97%～14.92%，其中未灭活的T4处理干质量、鲜质量增幅最高，与CK相比鲜质量平均增加 17.98 g，增幅达到13.55%，差异达到极显著水平，干质量平均增加1.32 g，增幅达到14.92%，差异达到极显著水平。灭活的发酵液处理T1、T3较清水对照也有不同程度的增产，分析原因，可能是发酵液中残留养分促进了白菜生长。结果表明，在施加底肥的基础上施用HB-1发酵液，可以显著提高白菜的生物产量。

2.316S rDNA测定结果

对菌株HB-1的16S rDNA基因部分序列进行BLAST

比对，利用MEGA 4.1的Neighbor-Joining软件进行系统发育树构建。由图3遗传距离可知，菌株HB-1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性最高（99.7%），与其他菌株的遗传距离相对较远，可以确定菌株HB-1是1株枯草芽孢杆菌。

3讨论与结论

从番茄根际土壤中分离筛选获得1株具有较好产IAA能力的革兰氏阳性菌株HB-1，其发酵24 h产IAA水平达到48 mg/L以上。通过将其培养后的发酵液进行白菜的促生试验表明，与冲施清水的处理相比，冲施灭活HB-1发酵液与未灭活发酵液对白菜均有促生作用，施加HB-1发酵液的处理叶绿素含量、叶片数均高于对照（CK）；鲜质量、干质量较CK相比都增加，鲜质量增加1.54～17.98 g，增幅达到116%～13.55%，差异达到显著水平；干质量增加0.26～1.32 g，增幅达到2.97%～14.92%。冲施1.0 mL未灭活发酵液处理较空白处理鲜质量可提高13.55%，差异达到极显著水平；冲施0.5 mL未灭活发酵液处理较空白处理鲜质量可提高6.48%，差异达到显著水平。试验结果表明，菌株HB-1具有较强的促生作用。通过对菌株的16S rDNA序列的测定和分析，鉴定菌株HB-1为枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌HB-1具有较好的产IAA能力，因为枯草芽孢杆菌具有非常好的生产性能及抗逆、定植能力，因此该菌株筛选为功能微生物肥料的研发提供了较好的选择。

参考文献：

[1]吴翔，甘炳成，黄忠乾，等. 一株产IAA菌株的筛选，鉴定及培养条件优化[J]. 四川农业大学学报，2014，32（4）：432-435.

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