水环境中乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻的致毒胁迫效应

王洪斌++赵鑫++金雪萍++肖龙海++韩雪++李士虎

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.134

摘要：以江苏省连云港市海州湾常见海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、巴夫藻（Pavlova viridis）为试验材料，研究水环境中乙草胺对2种海洋微藻的致毒胁迫效应。以叶绿素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量为指标，研究2种海洋微藻的生长量及细胞内抗氧化系统对乙草胺致毒胁迫的响应。结果表明：塔胞藻、巴夫藻2.5 mg/L试验组培养至7 d，生长量分别为对照组的6.4%、6.0%；96 h培养时间内，乙草胺对塔胞藻及巴夫藻叶绿素a含量的影响表现在降低叶绿素a的合成量，2.5 mg/L试验组叶绿素a的含量分别为对照组的26%、28%；乙草胺对2种微藻的SOD活性均表现诱导性上升，1.0 mg/L试验组达最高值，是对照组的158倍；塔胞藻、巴夫藻0.5 mg/L试验组CAT活性达最高值，分别是对照组（0 mg/L）的1.5、1.4倍；2种微藻体内MDA含量随乙草胺处理浓度增加而明显提高，塔胞藻、巴夫藻在2.5 mg/L试验组达最高值，均为对照组15倍以上。一定浓度的乙草胺对塔胞藻及巴夫藻具有强烈的致毒胁迫效应，不同海洋微藻对乙草胺致毒胁迫的响应存在种属差异性。

关键词：乙草胺；塔胞藻；巴夫藻；致毒效应

中图分类号： TQ450.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0465-03

收稿日期：2015-08-06

基金项目：国家级高等学校大学生创新创业训练计划（编号：201411641049Y）；江苏省海洋资源开发研究院开放课题（编号：JSIMR201319）

作者简介：王洪斌（1966—），男，江苏连云港人，硕士，教授，研究方向为环境微生物生物技术。E-mail：lygwhbly@126.com。乙草胺是一种广泛使用的选择性酰胺类芽前除草剂，主要适用于防除禾本科杂草和阔叶杂草，它能被杂草的幼芽和幼根吸收，抑制杂草蛋白质合成而使杂草死亡[1-3]。由于酰胺类除草剂具有较高的水溶性及相对较低的土壤吸附常数，施用到农田的乙草胺容易通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流而造成水体污染，直接或间接对人体健康造成危害[4]。而乙草胺是我国使用最多的3种除草剂（甲草胺、乙草胺和丁草胺）之一[5]，所以乙草胺使用后在环境中的归宿及残留污染对人和动物的毒性成为学者关心的热点。

浮游藻类具有取材方便、易于培养和操作的特点，对化学污染物的致毒胁迫敏感，浮游藻类受残留污染物致毒胁迫而产生活性氧自由基，能够引发一系列氧化应激反应，产生有毒代谢产物，对生物体的细胞造成损伤，最终导致细胞死亡[6]。由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等组成的抗氧化系统能够有效防御活性氧自由基的侵害。丙二醛（MDA）产生与脂质过氧化程度相关，可以指示细胞机体受到氧化损伤的程度[7-9]。研究表明，许多农药能够抑制生物体内抗氧化酶的活性，导致生物体内活性氧自由基含量的增加，对生物体构成氧化胁迫。目前，国内外关于农药残留污染的研究主要集中在它们对水生生物的急性毒性效应[10]，而乙草胺对海洋微藻抗氧化酶活性影响的研究尚属空白。本研究以江苏省连云港市海州湾常见海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、绿色巴夫藻（Pavlova viridis）为试验材料，研究水环境中乙草胺对2种微藻的致毒胁迫效应。以叶绿素a含量、超氧化歧化酶活性、过氧化氢酶活性及丙二醛含量为指标，研究2种海洋微藻的生长及细胞内抗氧化系统对乙草胺致毒胁迫的响应，旨在提示农药污染对水环境破坏的严重性，揭示海洋微藻作为环境毒理学评价指标的潜在应用，并为乙草胺的合理安全使用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

塔胞藻、绿色巴夫藻均为淮海工学院海洋学院海藻实验室保存种。微藻培养液采用f/2加富海水，海水采自连云港市连岛海域（盐度3.10%～3.20%）涨潮时，醋酸纤维薄膜过滤，121 ℃灭菌20 min待用。

乙草胺（济南天邦化工有限公司生产的50%乳油）用蒸馏水稀释为500 mg/L，备用。

1.2方法

1.2.1微藻培养方法藻种在f/2培养液中培养到指数生长期为接种物。微藻培养采用f/2海水培养液，不通气静止培养，在无菌条件下将20 mL处于指数生长期的藻种接种于装有180 mL f/2培养液的500 mL锥形瓶中，光照度为 3 000 lx，光—暗周期12 h—12 h，每天定时摇动3次，（23±1）℃下培养[11]。

1.2.2微藻生长测定取培养至4 d的藻液100 mL，分别加入0、100、200、300、400、500 μL乙草胺溶液，使乙草胺浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。采用吸光度法定时对其生长进行测定。以接种时间为初始时间开始测定，每天定时取出5 mL藻液。以未接任何藻种的f/2加富海水营养液为空白对照，在波长680 nm下测定其D680 nm值，连续7 d[12]。试验设3个平行组。

1.2.3叶绿素a测定采用丙酮提取法。取培养96 h的藻液10 mL，5 000 r/min离心10 min，收集藻泥，加3 mL 80%丙酮，冻融3次，超声波破碎细胞、离心，上清液即为叶绿素a提取液[13]。

1.2.4SOD活性、CAT活性、MDA含量检测试验根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。所有试验均重复3次，数据取平均值，并分析其差异显著性。

2结果与分析

2.1乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻生长特性的影响

由图1可见，处理组塔胞藻在培养3 d后，表现出强烈抑制效应，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L组培养7 d，D680 nm分别只有对照组的24.0%、18.0%、10.0%、7.4%、6.4%。由图2可见，低浓度的乙草胺（≤1.0 mg/L）对绿色巴夫藻生长胁迫作用不明显，在培养3 d后，生长水平与对照组（0 mg/L）相比，表现出抑制效应，0.5、1.0 mg/L组培养7 d后，分别是对照组的69%、70%；而1.5、2.0、2.5 mg/L 组表现出强抑制效应，培养7 d后分别是对照组的10.0%、6.0%、6.0%。乙草胺浓度高于0.5 mg/L，对2种微藻表现出明显抑制作用，说明高浓度的乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻具有强烈的致毒效应。试验还证实，不同浓度乙草胺对不同微藻生长的胁迫作用存在差异。

2.2乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻叶绿素a合成的影响

乙草胺对塔胞藻及绿色巴夫藻叶绿素a的影响主要表现在降低叶绿素a的合成量，呈现明显的剂量效应（图3）。培养至96 h，与对照组相比，试验组塔胞藻及绿色巴夫藻叶绿素a的含量均随浓度增加而降低，塔胞藻较绿色巴夫藻下降幅度尤为明显，塔胞藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 试验组，叶绿素a含量分别为对照组的59%、50%、37%、30%、26%，经分析，0.5、1.0 mg/L组与对照组差异显著（P<0.05），而其他各试验组与对照组相比差异极显著（P<0.01）。绿色巴夫藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L试验组叶绿素a含量分别为对照组的77%、65%、38%、31%、28%，经分析，0.5、1.0 mg/L 组与对照组差异不显著，而其他各试验组与对照组比较有极显著差异（P<0.01）。2种微藻比较可知，低浓度乙草胺对塔胞藻的叶绿素a合成致毒胁迫效应远大于绿色巴夫藻，高浓度乙草胺对叶绿素a合成的影响趋向一致，与“2.1”节所述的生长状况结论是一致的，不同微藻对农药致毒胁迫的响应存在较大的种属差异性。

2.3乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻SOD活性的影响

乙草胺处理2种微藻96 h后SOD活性变化见图4，可见低浓度乙草胺对2种微藻的SOD活性均表现诱导性上升。塔胞藻在1.0 mg/L试验组达最高值，是对照组的1.58倍，差异极显著（P<0.01）；随乙草胺质量浓度加大，SOD活性逐渐下降，2.5 mg/L试验组恢复至对照组水平。绿色巴夫藻也在 1.0 mg/L 试验组达最高值，是对照组的1.81倍，差异极显著（P<0.01）；后缓慢降低，与塔胞藻类似，在2.5 mg/L乙草胺处理下恢复至对照组水平。

2.4乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻CAT活性的影响

图5显示乙草胺处理2种微藻96 h后CAT活性变化情况，可见塔胞藻0.5 mg/L试验组CAT活性达最高值，是对照组（0 mg/L）的1.5倍；随乙草胺浓度的进一步上升而下降，2.5 mg/L 试验组CAT活性是对照组的95%，基本恢复至对照组水平。绿色巴夫藻也在0.5 mg/L试验组CAT活性达最高值，是对照组的1.4倍；2.5 mg/L试验组CAT活性是对照组的94%，基本恢复至对照组水平。各试验组与对照组比较，差异性均不显著。

2.5乙草胺对塔胞藻、绿色巴夫藻MDA含量的影响

图6显示，96h培养时间内，2种微藻体内MDA含量随

乙草胺处理浓度增加而明显增高，2种微藻在0.5 mg/L试验组与对照组（0 mg/L）相比即大幅度升高，且随乙草胺质量浓度加大而明显增加；在2.5 mg/L试验组达最高值，为对照组15倍；绿色巴夫藻在1.5 mg/L时MDA含量就高达对照组15倍，后增长趋势平缓，2.5 mg/L试验组也达最高值，为对照组16倍，差异性均为极显著（P<0.01）。MDA含量反映机体受过氧化损伤程度，塔胞藻、绿色巴夫藻对乙草胺致毒胁迫的响应存在差异。2种海洋微藻MDA含量变化与其生长特性的响应是一致的。

3讨论

农作物施用农药和沿海一些农药生产厂的排污已对近海水域构成污染，目前，农药残留污染对海洋生物资源、养殖生态环境的破坏性影响已引起广大学者的高度重视。因此监测海洋农药残留污染对保护海洋生物资源及生态修复具有重要意义，本研究用乙草胺残留污染对海洋微藻的致毒胁迫效应进行初步研究，探讨其对海洋微藻毒性效应，为农业生产上合理、安全使用酰胺类除草剂提供理论依据。

本研究以江苏省连云港市海州湾常见藻种塔胞藻、绿色巴夫藻为供试藻，实验室条件下研究乙草胺致毒胁迫对2种海洋微藻生长、抗氧化系统及叶绿素a合成的影响。试验证实，高浓度乙草胺具有强烈的毒性效应，从对叶绿素含量影响情况看出，乙草胺对绿色巴夫藻的致毒胁迫效应远大于塔胞藻，与对其生长特性胁迫影响的结论一致，不同微藻对农药致毒胁迫的响应存在较大的种属差异性。乙草胺对海洋微藻的毒性影响远大于另一种除草剂草甘膦[14]。

SOD和CAT活性是好氧生物抗氧化机制的主要活性酶，其活性变化可以反映微藻抵御污染物胁迫能力[15]。本研究显示，低浓度乙草胺对2种微藻的SOD活性均有诱导性刺激上升作用，反映微藻受乙草胺氧化胁迫，机体抗氧化能力增强，而后随乙草胺浓度增加逐渐下降，在质量浓度1.0 mg/L时，SOD活性达最高，在质量浓度 2.5 mg/L 时恢复至对照组水平，没有出现抑制效应，与刘霞等结论[16]不一致，至于多少质量浓度的乙草胺能诱导机体产生过量的超氧阴离子自由基，超出机体的清除能力而导致藻体暴发性死亡，有待进一步研究。对CAT活性表现趋势同SOD。MDA是生物膜中多种不饱和脂肪酸在活性自由基攻击后产生的过氧化产物，其含量高低反映藻细胞膜过氧化损伤程度，2种MDA含量反应与其生长特性的响应一致，96 h培养时间，随乙草胺处理浓度加大，MDA含量显著增加，表明微藻体内活性自由基积累，脂质过氧化产物增加，有毒代谢产物大量积累，MDA含量与污染物的浓度呈正相关，与刘霞等试验结果[16-17]一致。

本研究没有涉及其他环境因素，对于乙草胺致毒效应机制以及微藻的种属差异、微藻的适应机制等需要进一步深入研究。

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