产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌M64的产酶条件优化及部分酶学性质研究

刘蒲临++程德勇++缪礼鸿

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.135

摘要：在紫外诱变的基础上，采用单因素试验和正交试验对侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus） M64发酵生产几丁质酶的培养条件和培养基进行优化，并对粗酶液的酶学特性进行了初步研究。结果表明，碳氮源的种类与浓度、培养温度、pH值以及表面活性剂吐温80浓度对该菌株产几丁质酶有显著影响。突变株使用优化后的培养条件，其发酵上清液中几丁质酶活力达到55.19 U/mL，为未优化前的2.56倍；粗酶液最适催化温度为60 ℃，且在80 ℃预处理2 h后仍具有降解几丁质的能力，表现出了良好的热稳定性。

关键词：侧孢短芽孢杆菌；几丁质酶；产酶条件；酶学性质

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0468-04

收稿日期：2015-09-29

基金项目：国家“863”高技术研究发展计划（编号：2013AA102805）；武汉轻工大学科研启动经费（编号：2014RZ19）。

作者简介：刘蒲临（1985—），男，湖北武汉人，博士，讲师，主要从事环境微生物学研究。Tel：（027）83956793；E-mail：liunan3585@163.com。

通信作者：缪礼鸿，博士，教授，主要从事资源与环境微生物学研究。Tel：（027）83956793；E-mail：miaowhpu@126.com。几丁质是由几丁质合酶以尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺为前体，催化N-乙酰葡糖胺以β-1，4糖苷键相连形成长链后，不同长链之间以反平行（α型）或平行（β型）的方式相互作用所形成的[1]。几丁质是构成丝状真菌和担子菌细胞壁的主要成分，同时广泛存在于节肢动物外骨骼和甲壳纲动物的外壳中[2]。据统计，自然界中每年产生的几丁质超过100亿t，是仅次于纤维素的第二大有机物[3]。

几丁质酶可以催化几丁质的水解，广泛存在于微生物和高等动植物体内[4]。微生物所产生的几丁质酶除了可以水解几丁质获取营养、赋予细菌竞争或寄生优势以外，还可以降解真菌细胞壁和昆虫几丁质外壳，进而应用于植物的病虫害防治[5]。此外，几丁质降解所形成的几丁寡糖具有抗菌、调节免疫力和抗癌等功效，在功能食品和保健药品等方面具有广阔的应用前景[6-7]。因此本研究以前期筛选得到的具有几丁质降解能力的侧孢短芽孢杆菌M64为出发菌株，通过紫外诱变和正交试验等手段提高和优化其发酵产酶能力并研究了粗酶液的部分酶学性质，为进一步研究开发其所产几丁质酶提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

侧孢短芽孢杆菌M64，由笔者所在课题组前期筛选得到。几丁质粉末购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2试验方法

1.2.1胶体几丁质制备将10 g几丁质粉末加入100 mL浓盐酸中，磁力搅拌2 h后室温静置24 h。将几丁质的酸溶液转移至1 L蒸馏水中，搅拌均匀。5 000 g离心10 min收集胶体几丁质沉淀。使用蒸馏水反复冲洗至pH值为6.5左右。最终使用200 mL蒸馏水重悬沉淀，获得5%的胶体几丁质母液。

1.2.2培养基配制（1）菌体扩增与计数培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。（2）初始发酵培养基，在Hoster等所使用培养基配方[8]基础上有所更改：胶体几丁质 5.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，CaCl2·2H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L。（3）突变株筛选培养基：初始发酵培养基中添加琼脂至浓度为15.0 g/L。

1.2.3几丁质酶酶活测定使用DNS法（3，5-二硝基水杨酸比色法）[9]，以β-D-N-乙酰氨基葡萄糖绘制标准曲线，分别对待测样品以及样品空白进行测定。将1 min产生相当于1 μmol β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个活力单位（U）。

1.2.4紫外诱变与突变株筛选将出发菌株接种至50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养 10 h。离心收集菌体，使用50 mL无菌生理盐水进行重悬，平板计数法测定菌悬液浓度。转移5 mL菌悬液至无菌培养皿中，在距离40 W紫外灯50 cm处，分别处理15～105 s。紫外照射完毕后，进行平板菌落计数，并按照以下公式计算致死率：

致死率=（照射前菌悬液浓度-照射后菌悬液浓度）/照射前菌液浓度×100%。

观察并测定菌落在胶体几丁质固体培养基上所形成的水解圈大小。挑取水解圈较大的单菌落接种至初始发酵培养基中，测定发酵液中几丁质酶的酶活。

1.2.5培养条件优化以初始发酵培养基为基础，通过单因素试验分别考察pH值、培养温度、培养时间和吐温80浓度对发酵液中几丁质酶活力的影响。

1.2.6培养基优化通过单因素试验确定不同培养基成分对发酵液中几丁质酶活力的影响，选取影响较大的因素进行正交试验，确定M64产几丁质酶的最佳培养基构成。

1.2.7粗酶液酶学性质研究（1）最适温度和pH值的测定：分别于20～80 ℃以及pH值为3.0～10.0条件下测定发酵上清液中几丁质酶的活性。（2）热稳定性的测定：将发酵上清液置于20～80 ℃下水浴 2 h 后检测酶活。

2结果与分析

2.1紫外诱变与突变株筛选

2.1.1紫外致死曲线菌株M64的紫外致死曲线如图1所示。当紫外处理时间为15 s时，菌体致死率为9.02%。随着处理时间延长至60 s，菌体致死率增长至87.22%。当紫外处理时间大于75 s时，菌体致死率已接近100%。本试验选择致死率在80%～90%的紫外线剂量，确定诱变所使用照射时间为60 s。

2.1.2紫外诱变后菌株的筛选经过紫外诱变的菌悬液经梯度稀释后涂布于含有1%胶体几丁质的固体培养平板上，避光培养72 h后观察透明圈产生情况。测量并计算透明圈直径（H）与菌落直径（C）的比值，从中挑选出比值较大的单菌落完成初筛。将比值较大的10株突变株分别划线纯化，培养形成种子液后以1%接种量接种至初始发酵培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养36 h，使用DNS法测定发酵液中几丁质酶活力。突变株筛选结果如表1所示。其中，菌株 M64-7几丁质酶活力最高，达到32.30 U/mL，为野生型菌株的1.50倍。突变株M64-7经过多次划线传代后酶活力保持稳定，具有较好的遗传稳定性，故以突变株M64-7进行后续相关试验。

2.2突变株培养条件的优化

2.2.1培养时间对几丁质酶产量的影响将过夜培养的突变株M64-7的菌液以1%接种量接种于初始发酵培养基中，37 ℃、180 r/min 振荡培养，每隔6 h测定发酵液中几丁质酶活和菌体生长量。图2表明，菌株M64-7在36 h产酶达到最大值，36 h与42 h几丁质酶活差异不显著。发酵液酶活变化曲线与菌体生长情况表现出了良好的一致性。

2.2.2培养温度与起始pH值对几丁质酶产量的影响将突变株M64-7的种子液以1%接种量接种至不同pH值或不同培养温度的初始发酵培养基中进行振荡培养（180 r/min），36 h后测定发酵液中的几丁质酶活力。图3表明，该菌株在初始pH值为7.0以及培养温度为37 ℃时，产酶达到最高水平。

2.2.3吐温80含量对几丁质酶产量的影响表面活性剂能增强细胞膜的通透性，从而提高几丁质酶产量。将非离子表面活性剂吐温80添加至初始发酵培养基中，至终浓度分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。在最适pH值和培养温度下培养36 h后，发酵上清液中的酶活如图4所示。当吐温浓度小于0.2%时，发酵液酶活随着吐温80浓度的增大而增强；吐温80浓度为0.2%时，发酵液酶活达到最大值。因此，本研究最终选择培养基中的吐温80浓度为0.2%。

2.3不同的培养基成分对发酵液中几丁质酶产量的影响

2.3.1氮源种类与浓度对几丁质酶产量的影响以初始发酵培养基为基础，在其他成分不变的条件下，分别添加不同浓度的酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl以及KNO3，比较不同氮源对几丁质酶产量的影响。在相同接种量和培养条件下，以有机物作为氮源有助于几丁质酶产量的提高，当培养基中含有8.0 g/L的酵母膏时，发酵液中几丁质酶活力达到 49.68 U/mL（图5-a）；而向培养基中添加无机氮（NH4Cl与KNO3）不会显著影响几丁质酶的产量（图5-b）。

2.3.2碳源种类与浓度对几丁质酶产量的影响在培养基中其他成分不变的条件下，分别添加不同浓度的胶体几丁质、葡萄糖和蔗糖，比较不同碳源对几丁质酶产量的影响，结果如图6所示。胶体几丁质含量由0.5%增加至2.5%时，几丁质酶产量先逐渐增加后趋于平缓，说明该菌株几丁质酶的表达受到外源几丁质的诱导；但当培养基中不含胶体几丁质时，几丁质酶仍有部分表达（图6-a）。以葡萄糖或蔗糖作为碳源时，发酵液中几丁质酶含量明显下降（图6-b）。

2.3.3缓冲盐浓度对几丁质酶产量的影响将初始发酵培养基中的磷酸盐浓度定义为100%，调整培养基中磷酸盐相对浓度至25%～200%不等，比较不同缓冲盐浓度对几丁质酶产量的影响，结果如图7所示。培养基中缓冲盐浓度为初始培养基缓冲盐浓度的50%～125%时，单位体积发酵液所表现出的几丁质酶活力稳定在较高水平；低于或高于该浓度范围均使几丁质酶的产量有所下降。

2.3.4培养基成分的正交优化根据单因素试验的结果，选择酵母膏作为氮源，胶体几丁质作为碳源和缓冲盐浓度一起进行正交试验，确定最佳培养基配方。菌体的发酵均在最佳培养条件下进行（含0.2%吐温80），结果如表2所示。使用SPSS 10.0对数据进行处理后，发现在α=005的显著性水平上酵母膏和胶体几丁质的浓度变化显著影响了几丁质酶的产量（P<0.05）；而培养基中的缓冲盐浓度的变化对几丁质酶产量的影响不显著。此外，极差（R）结果表明，酵母膏浓度对几丁质酶产量的影响较大。考察上述3个因素在4个水平上的变化之后，得出最佳产酶培养基成分为：酵母膏 6.0 g/L，胶体几丁质含量 2.0%，缓冲盐浓度为初始发酵培养基的50%。经重复试验验证，使用该配方后，菌株M64-7酶活稳定在（55.19±0.48） U/mL。

2.4温度与pH值对发酵液中几丁质酶活力的影响

温度与pH值对几丁质酶活力的影响如图8所示。发酵液最适催化温度为60 ℃；当反应温度为80 ℃时，酶活为最高值的41.17%（图8-a）。图8-b表明，发酵液在pH值为70时表现出了最高酶活力。为了进一步研究几丁质酶对高温的耐受能力，将发酵液分别置于20～80 ℃预处理2 h，在60 ℃以及pH值=7.0的条件下测定残余的酶活力，结果（图8-c）表明，经过60 ℃预处理后，其酶活力没有受到显著影响；当预处理温度提高至80 ℃时，其酶活力仍为原来的3775%，具有较强的热稳定性。

3讨论与结论

侧孢短芽孢杆菌在自然界中常常定殖于水体、土壤以及昆虫的体表，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目的多种昆虫以及一些线虫具有杀灭作用；该菌还产生与拮抗性有关的酶和抗生素，抑制多种病原细菌或真菌的生长[10]。几丁质酶已被证明是微生物产生真菌拮抗能力的重要原因之一，然而国内尚未对侧孢短芽孢杆菌中几丁质酶的产量及其影响因素展开研究。因此，本试验以前期所筛选的侧孢芽孢杆菌M64为基础，通过紫外诱变提高其产酶能力，并探索其产酶的最佳条件与影响因素。该菌株产几丁质酶的最佳培养温度为37 ℃，最佳酸碱度为pH值=7.0。培养基中碳源和氮源的种类与浓度对几丁质酶的产量有显著影响。胶体几丁质可以诱导几丁质酶的表达，葡萄糖等速效碳源对几丁质酶的产生有明显的抑制作用。 有机氮源浓度的提高也有助于菌体合成并分泌几丁质酶。当发酵培养基中酵母膏浓度由2 g/L提高至8 g/L时，发酵液中几丁质酶的含量提高了31%。经过紫外诱变与培养条件优化之后，突变株发酵液酶活达到55.19 U/mL，为初始野生型菌株的2.56倍。酶学分析表明，菌株M64-7发酵液中几丁质酶的最适反应温度为60 ℃，80 ℃预处理2 h仍具有37.75%的催化活性。Karthik等研究指出，微生物几丁质酶的最适反应温度主要介于40～60 ℃之间，耐受温度平均在50 ℃左右[11]。因此，M64-7所分泌几丁质酶的耐热性处于较高水平。综上所述，本研究探索了影响侧孢短芽孢杆菌产几丁质酶的几个营养因素，并显著提高了几丁质酶的产量，为该菌株在几丁质废弃物生物转化以及生物拮抗方面的推广与应用奠定了良好的基础。

参考文献：

[1]Manjeet K，Purushotham P，Neeraja C，et al. Bacterial chitin binding proteins show differential substrate binding and synergy with chitinases[J]. Micorbiological Reaearch，2013，168：461-468.

[2]钟万芳，丁少军. 细菌几丁质酶的结构与功能研究进展[J]. 江苏农业科学，2012，40（4）：1-3.

[3]Suma K，Podile A R. Chitinase A from Stenotrophomonas maltophilia shows transglycosylation and antifungal activities[J]. Bioresource Technology，2013，133：213-220.

[4]Laribi-Habchi H，Bouanane-Darenfed A，Drouiche N，et al. Purification，characterization，and molecular cloning of an extracellular chitinase from Bacillus licheniformis strain LHH100 isolated from wastewater samples in Algeria[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2015，72：1117-1128.

[5]付星，闫巧娟，江正强，等. 高产几丁质酶巴伦葛类芽孢杆菌的筛选和发酵条件优化[J]. 微生物学通报，2015，42（4）：625-633.

[6]Nanjo F，Sakai K，Ishikawa M，et al. Properties and transglycosylation reaction of a chitinase from Nocardia orientalis[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1989，53：2189-2196.

[7]Usui T，Matsui H，Isobe K. Enzymic synthesis of chitooligosaccharides utilizing transglycosylation by chitinolytic enzymes in a buffer containing ammonium sulfate[J]. Carbohydrate Research，1990，203：65-77.

[8]Hoster F，Schmitz J E，Daniel R. Enrichment of chitinolytic microorganisms：isolation and characterization of a chitinase exhibiting antifungal activity against phytopathogenic fungi from a novel Streptomyces strain[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，66：434-442.

[9]Miller G L. Use of dinitrisalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959，31：426-428.

[10]Ruiu L. Brevibacillus laterosporus，a pathogen of invertebrates and a broad-spectrum antimicrobial species[J]. Insects，2013，4：476-492.

[11]Karthik N，Binod P，Pankey A. Purification and characterization of an acidic and antifungal chitinase produced by a Streptomyces sp.[J]. Bioresouce Technology，2015，188：195-201.