西藏自治区产碱性弹性蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离及鉴定

马长中++辜雪冬++池福敏++罗章++杨林

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.144

摘要：从西藏自治区不同海拔地区的屠宰场土壤中分离得到180株菌株，经过初筛和复筛，获得1株产碱性弹性蛋白酶较高的菌株XZJ4，结合生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

关键词：碱性弹性蛋白酶；分离；鉴定；枯草芽孢杆菌

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0502-03

收稿日期：2015-11-14

基金项目：西藏自治区自然科学基金（编号：Z2012A076）。

作者简介：马长中（1975—），男，四川遂宁人，硕士，副教授，主要从事高原特色农畜产品加工及贮藏研究。Tel：（0894）5826471；E-mail：414767450@qq.com。弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，是一种肽链内切酶[1-2]，广泛存在于动物胰脏和微生物类群中，细菌、真菌、放线菌中均存在。弹性蛋白酶是一种经济价值较高的酶制剂[3-4]。弹性蛋白酸作为一种水解专一性较广的内肽酶，对很多蛋白质均有水解能力[5]。当弹性蛋白与其他蛋白共存时，它会优先水解弹性蛋白，弹性蛋白酶可作为理想的肉类嫩化剂应用于食品工业和日常生活中[6-7]。此外，弹性蛋白酶还可应用于农副产品深加工、高蛋白食品制作、罐头工业，也可作为益生菌保健食品的促菌剂和婴儿食品的强化剂[8-10]。胰脏是弹性蛋白酶的主要来源，由于脏器资源不足，胰弹性蛋白酶一直供不应求。由微生物发酵生产弹性蛋白酶成本低、产量大、设备利用率高，且不受原料来源的限制；因此，利用微生物发酵生产弹性蛋白酶是一条有效途径。目前，由微生物发酵法生产弹性蛋白酶，关键在于筛选到产弹性蛋白酶的高产菌株。本研究首次从西藏自治区不同海拔地区的屠宰场附近采集土样，并从中分离得到产碱性弹性蛋白酶的菌株XZJ4，结合生理生化特征和16S rDNA，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

1材料与方法

1.1样品采集

选取西藏自治区林芝市、拉萨市、日喀则市、阿里地区4个不同海拔地区的屠宰场，在其附近的土样中采集样品共30份。

1.2主要试剂

pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶 HindⅢ、T4DNA连接酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司。小量PCR产物试剂盒购自Omega Bio Tek公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3培养基

培养基的配制参照文献[11]。

1.4培养方法

种子斜面及平板培养均于37 ℃下培养24 h。进行复筛发酵培养时，将20 mL发酵培养基加入250 mL三角瓶中，接种后置于旋转式摇床，于32～37 ℃、180 r/min条件下发酵培养24 h。

1.5粗酶制备[12]

将细菌发酵液以10 000 r/min离心10 min，收集去菌体发酵液进行硫酸铵分级盐析（30%～65%饱和度），将沉淀溶于0.05 mol/L、pH值9.0的硼酸缓冲液中即为粗酶液。

1.6酶活力的测定

采用分光光度法[13]测定弹性蛋白酶活力。称取10 mg刚果红-弹性蛋白溶于1 mL水中，加入1 mL适当稀释的酶液以及1 mL pH值7.4的0.2 mol/L硼酸缓冲液，于37 ℃下振荡反应30 min；加入2 mL pH值6.0的0.7 mol/L磷酸钠缓冲液终止反应，过滤后取上清液，于波长495 nm处测定光密度，采用蒸馏水替代酶液的反应体系为空白对照。在此反应条件下，溶解1 mg刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为1个弹性蛋白酶活力单位（U）。

1.7菌落形态观察及生理生化特征

菌体形态特征观察和生理生化鉴定的方法主要参照文献[14-16]。

1.8XZJ4菌株的分子生物学鉴定

采用16S rDNA寡核苷酸通用引物：P1，5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；P2，5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应按以下扩增程序进行：96 ℃预变性1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经电泳检测后，将剩余的PCR产物纯化，连接到pMD18-T载体，委托上海鼎安生物科技有限公司完成。采用Blast在线软件对测序结果进行相似性分析，构建系统进化树。

2结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌的筛选

通过对30个样品进行混合富集培养、弹性蛋白平板初筛、分离纯培养，获得180株产碱性弹性蛋白酶的菌株。对弹性蛋白水解圈与菌落直径之比（H/C）较大的90株菌株进行摇瓶复筛，得到1株酶活力最高的菌株，编号为XZJ4，酶活为33 U/mL。

2.2菌株XZJ4的形态和生理生化特征

2.2.1形态特征将菌株XZJ4接种于弹性蛋白培养基上，于30 ℃下倒置培养48 h，形成蛋白水解圈（图1）。图1显示，该菌株菌落呈圆形、乳白色、不透明，隆起度较高。显微镜下形态见图2，为革兰氏阳性杆菌，大小（宽×长）为（1.0～1.4） μm×（2.0～2.4） μm，两端钝圆，单个排列或短链状排列。芽孢椭圆位于菌体中央，有鞭毛，无荚膜。

2.2.2生理生化特征由生理生化特征试验结果（表1）可知，菌株XZJ4葡萄糖产酸、水解淀粉、木糖产酸、L-阿拉伯糖产酸、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、接触酶、甘露醇产酸试验为阳性，葡萄糖产气、厌氧生长、吲哚、丙二酸盐、卵黄卵磷脂酶试验为阴性，这与已报道的枯草芽孢杆菌具有相同或近似的生理生化特征[17-18]。

表1菌株XZJ4的生理生化特征

特征试验结果葡萄糖产酸+水解淀粉+木糖产酸+L-阿拉伯糖产酸+柠檬酸盐利用+硝酸盐还原+接触酶+甘露醇产酸+葡萄糖产气-厌氧生长-吲哚-丙二酸盐-卵黄卵磷脂酶-注：“+”为阳性，“-”为阴性。

2.3菌株XZJ4的分子生物学鉴定

利用P1、P2引物扩增16S rDNA区域，片断大小约为 1 500 bp（图3），与预期相符。将产物进行凝胶电泳检测，纯化后连接pMD18-T载体，筛选出的阳性转化子委托上海鼎安生物科技有限公司完成。

将测序结果在GenBank的Blast上进行比对，扩增片段与GenBank上报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis，GenBank登录号NBRC13719）16S rDNA的同源性达100%，与枯草芽孢杆菌（GenBank登录号JCM1465）16S rDNA的同源性达99%。序列采用Blast软件与数据库中已知的16S rDNA进行相似性比对，应用ClustalX软件对目的序列进行比对和聚类分析，使用MEGA 6.06生物软件构建进化树（图4）。

系统进化树结果表明，XZJ4菌株属于芽孢杆菌属，与模式菌株枯草芽孢杆菌亲缘性最近。

3结论与讨论

选取西藏自治区不同海拔地区的屠宰场，在其附近的土样中采样30份样品。通过混合富集培养、弹性蛋白平板初

筛、分离纯培养获得180株产碱性弹性蛋白酶的菌株，对弹性蛋白水解圈与菌落直径之比（H/C）较大的90株菌株进行摇瓶复筛，得到1株酶活力最高的菌株，编号为XZJ4，酶活为 30 U/mL。结合生理生化和16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。本研究为进一步筛选高产碱性弹性蛋白酶菌株及其工业化发酵奠定了基础，下一步可通过克隆该菌株的弹性蛋白酶基因构建基因工程菌，以期为西藏自治区本土碱性弹性蛋白酶的工业化发酵生产提供依据。

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