蟾酥水提取物对小鼠免疫功能的影响

梁正敏,何家康,2,安宝聚,徐杨峰,聂海英,韦英益

(1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005； 2.广西兽药制剂工程技术研究中心，广西 南宁 530003)



蟾酥水提取物对小鼠免疫功能的影响

梁正敏1,何家康1,2,安宝聚1,徐杨峰1,聂海英1,韦英益1

(1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005； 2.广西兽药制剂工程技术研究中心，广西 南宁 530003)

研究新提取的蟾酥水提取中试产品体内外对小鼠免疫功能的调节作用。体内实验设蟾酥水提取物的高(2 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.5 mg/kg)剂量组、左旋咪唑组和生理盐水组，连续腹腔注射给药3 d后分别测定小鼠脾脏和胸腺指数、血液白细胞分类计数、血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ浓度和脾淋巴细胞体外增殖能力；无菌分离健康小鼠的脾淋巴细胞进行体外培养，加入不同质量浓度的蟾酥水提取物(20、10、5 μg/ml)，协同LPS或Con A共同孵育48 h后，采用MTT法测定脾淋巴细胞增殖能力和ELISA法测定脾淋巴细胞上清液中的IL-2、IL-12、IL-4和IFN-γ含量。该蟾酥水提取物能协同Con A和LPS促进脾T、B淋巴细胞的体外增殖能力(P<0.01)，促进免疫器官生长。明显提高小鼠血清和脾淋巴细胞上清液中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平(P<0.01)。该蟾酥水提取物中试产品通过促进小鼠免疫细胞的增殖活性和细胞因子的分泌水平而发挥其免疫调节作用。

蟾酥水提取物；小鼠；免疫；器官指数；细胞因子；增殖

蟾酥为蟾赊科中华大蟾赊或黑眶蟾赊等的耳后腺及皮肤分泌的白色浆液,经加工干燥制成，性味甘辛、温、有毒[1]。蟾酥的化学成分主要有蟾蜍毒素类、蟾毒配基类、蟾毒色胺类等[2]。蟾酥具有较好的强心、升压、兴奋中枢、抗炎、抗肿瘤、局部麻醉、提高机体免疫水平等作用[2]。有研究报道蟾酥注射液和华蟾毒精能够显著增强小鼠脾淋巴细胞体外对非特异性免疫刺激原的反应，同时能够对调节Th1/Th2型细胞因子动态平衡起作用[3-4]，宋宇等[5]发现蟾酥的成分之一华蟾毒精能够明显改善由环磷酰胺所引起的免疫低下作用。我们研究新改进工艺提取的蟾酥水提取中试产品对体内外小鼠免疫功能的调节作用，为该蟾酥制剂的临床推广应用奠定理论基础和提供科学的根据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠60只，体重(20±2)g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心。小鼠适应性饲养3 d后用于实验，自由饮水饮食，温度(24±1)℃，相对湿度为40%～60%。

1.2 药物与试剂

蟾酥水提取物的制备：将蟾酥粉碎，用10倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使含醇量达80%，搅匀，静置，冷藏，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；加适量注射用水，搅匀，静置，冷藏，滤过，滤液即为蟾酥水提取物，经检测每1 ml含吲哚类总生物碱以5-羟色胺计为200.2 μg。本研究所选蟾酥水提取物的剂量是基于先前本课题组对蟾酥水提取物体外抗炎的研究，参考文献[6]。

刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、MTT和台盼蓝均为Sigma产品；胎牛血清、RPMI-1640 完全培养液为Gibco产品；IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ ELISA检测试剂盒为欣博盛产品。

1.3 蟾酥水提取物对小鼠免疫功能影响实验

1.3.1 实验分组与处理

将50只小鼠随机分成5个组，即高(4 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.5 mg/kg)剂量的蟾酥水提取物组、左旋咪唑阳性对照组(25 mg/kg)、空白对照组。连续3 d腹腔注射蟾酥水提取物、左旋咪唑，空白对照组注射等量生理盐水。第4天，小鼠称重后眼球采血，瑞士吉姆萨染色血涂片做白细胞分类计数，分离血清置于-80℃保存用于细胞因子的测定，分离脾脏和胸腺，称重，用于计算脾脏指数和胸腺指数。

1.3.2 脾脏、胸腺指数测定

按以下公式计算小鼠器官指数：

1.3.3 血液白细胞计数

取小鼠新鲜血液10 μl于490 μl的3%的冰乙酸中，取一滴于血球计数板上，显微镜下计血液白细胞总数。另取少量血液均匀涂片，瑞士吉姆萨染色，用血细胞计数器在显微镜下进行白细胞分类计数。每张玻片至少计数300个白细胞。

1.3.4 血清中IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ含量测定

小鼠眼球采血，4℃斜面放置过夜，3 000 r/min离心10 min，取血清置于-80℃冰箱内保存，用于测定IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平。按ELISA试剂盒说明书操作。

1.3.5 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞体外增殖能力[4]

1.3.5.1 小鼠脾淋巴细胞混悬液的制备

无菌取小鼠脾脏至于灭菌平皿中，PBS清洗表面血渍，用玻璃注射器内芯进行研磨。经200目尼龙网过滤，收集脾细胞滤液，1 500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀。加入Tris-NH4Cl裂解液，室温放置10 min后1 500 r/min离心5 min，弃上清液；沉淀的细胞用PBS液洗2次，用RPMI-1640完全培养液洗涤2次后重悬。台盼蓝染色，活细胞数大于95%，计数，备用。

1.3.5.2 小鼠脾T、B淋巴细胞增殖能力实验

调小鼠脾淋巴细胞为1×106个/ml，每孔加入100 μl，接种于96孔培养板，设Con A刺激组、LPS刺激组和空白对照组，Con A刺激组加入100 μl的终质量浓度为5 μg/ml的Con A，LPS刺激组加入100 μl的终质量浓度为20 μg/ml的LPS，空白对照组加入等量培养液，每个实验组设6个重复孔。37℃，5% CO2培养箱培养44 h，加入20 μl的MTT (质量浓度5 mg/ml)，37℃孵育4 h，平板离心机1 800g离心10 min，吸弃细胞上清液，每孔加入100 μl DMSO，摇匀后静置10 min，用酶标仪测定OD490 nm。脾淋巴细胞增殖能力以刺激指数(SI)表示：

1.4 蟾酥水提取物对小鼠体外培养脾淋巴细胞免疫调节实验

1.4.1 制备小鼠脾淋巴细胞悬液

制备健康小鼠的脾淋巴细胞悬液，方法同1.3.5.1。

1.4.2 实验分组与处理

实验设单药组、Con A刺激组、LPS刺激组。单药组设高(20 μg/ml)、中(10 μg/ml)、低(5 μg/ml)剂量蟾酥水提取物组和空白对照组，Con A刺激组设蟾酥水提取物协同Con A组和Con A对照组，LPS刺激组设蟾酥水提取物组协同LPS组和LPS对照组；Con A刺激组加入的终质量浓度为5 μg/ml的Con A，LPS刺激组加入终质量浓度为20 μg/ml的LPS，空白对照组加入等量完全培养基，每个实验组设6个重复孔，重复3次实验。

1.4.3 MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖影响

调整小鼠脾淋巴细胞为5×106个/ml，每孔加入100 μl接种于96孔培养板，每孔加入100 μl用培养液稀释的不同质量浓度蟾酥水提取物，加入10 μl终质量浓度为5 μg/ml的Con A或20 μg/ml的LPS，37℃，5% CO2培养44 h，加入20 μl的MTT (质量浓度5 mg/ml)，孵育4 h，MTT检测方法同1.3.5.2。

1.4.4 ELISA法测细胞上清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平

每孔加入400 μl已制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液于24孔细胞培养板培养，加入400 μl不同质量浓度蟾酥水提取物，再加入50 μl终质量浓度为5 μg/ml的Con A，于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，3 000 r/min离心5 min，收集上清液冻存于-80℃用于IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ浓度检测。按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 统计学处理

实验数据用SPSS17.0软件进行分析，结果用“平均数±标注误”表示，组间比较采用单因素ANOVA分析及t检验。以“P<0.05”代表差异性显著，“P<0.01”代表差异性极显著。

2 结果与分析

2.1 蟾酥水提取物对脾脏、胸腺指数的影响

蟾酥水提取物对脾脏、胸腺指数的影响见图1。

图1 蟾酥水提取物对脾脏、胸腺指数的影响

注：“*”和“**”分别表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

由图1可知，与空白对照组相比，低剂量组的脾脏指数和中剂量组的胸腺指数显著提高(P<0.05)；且中剂量组的脾脏指数和高剂量组的脾脏、胸腺指数极显著提高(P<0.01)。结果表明，该蟾酥水提取物有可能通过促进免疫器官的发育而发挥机体免疫调节作用。

2.2 蟾酥水提取物对血液中白细胞的影响

血液中白细胞分类计数结果显示，高、中剂量的蟾酥水提取物组能显著增加血液中白细胞总数，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)，见图2。高、中剂量组极显著促进血液中淋巴细胞的增殖(P<0.01)，见图3。结果表明，该蟾酥水提取物能促进白细胞增殖，其中以淋巴细胞的增殖最为明显。

图2 蟾酥水提取物对白细胞总数的影响

图3 蟾酥水提取物对白细胞分类计数影响

2.3 蟾酥水提取物体内对小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的影响

蟾酥水提取物对小鼠血清中细胞因子的影响见图4。

图4 蟾酥水提取物对小鼠血清中细胞因子的影响

由图4可见，高、中剂量组的蟾酥水提取物明显提高小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平。与空白对照组比较，高剂量蟾酥水提取物极显著升高血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平(P<0.01)；中剂量蟾酥水提取物极显著提高血清中IL-4和IL-12水平(P<0.01)，显著增加IL-2和IFN-γ浓度(P<0.05)；低剂量蟾酥水提取物极显著上调IL-2水平(P<0.01)，但对IL-4、IL-12和IFN-γ水平无显著影响。结果表明，该蟾酥水提取物能通过上调血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ分泌水平发挥其免疫调节作用。

2.4 蟾酥水提取物对体内脾淋巴细胞增殖能力的影响

蟾酥水提取物对体内小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响见图5。

图5 蟾酥水提取物对体内小鼠脾淋巴 细胞增殖能力的影响

由图5可见，高、中剂量组的蟾酥水提取物能促进Con A或LPS诱导的小鼠脾T、B淋巴细胞体外增殖能力，与空白对照组比较差异极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)。另外，蟾酥水提取物对正常小鼠T、B淋巴细胞体外增殖能力无显著影响。结果表明了该蟾酥水提取物可通过增强小鼠体内脾淋巴细胞增殖能力，从而参与机体的免疫调节作用。

2.5 蟾酥水提取物体外对小鼠脾淋巴细胞体外培养增殖的影响

蟾酥水提取物体外对体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见图6。

图6 蟾酥水提取物体外对体外培养的小鼠 脾淋巴细胞增殖的影响

由图6可见，与空白对照组比较，单药组的高剂量蟾酥水提取物极显著促进体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖能力(P<0.01)，中剂量显著促进脾淋巴细胞增殖(P<0.05)。与Con A对照组比较，高、中剂量蟾酥水提取物对脾T淋巴细胞的增殖有极显著促进作用(P<0.01)。与LPS对照组比较，高、中剂量极显著促进脾B淋巴细胞增殖(P<0.01)。结果表明，蟾酥水提取物能显著提高体外培养的脾淋巴细胞增殖能力，并具有一定量效关系，随着蟾酥水提取物质量浓度的升高，刺激指数也随着升高。

2.6 蟾酥水提取物对体外培养的脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的影响

蟾酥水提取物可促进无Con A刺激的脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ，但与空白对照比相比差异不显著，见图7。在Con A协同作用下，高、中剂量蟾酥水提取物极显著促进脾淋巴细胞分泌IL-12(P<0.01)，高剂量蟾酥水提取物显著增加IL-2、IL-4和IFN-γ分泌(P<0.05)，中、低剂量蟾酥水提取物对IL-2、IL-4和IFN-γ分泌有促进作用，但与空白对照组比差异不显著，见图8。

图7 蟾酥水提取物对体外培养的小鼠脾 淋巴细胞分泌细胞因子的影响

图8 蟾酥水提取物对Con A诱导的小鼠脾 淋巴细胞分泌细胞因子的影响

3 讨论

动物机体免疫器官状态在一定程度上能反映免疫细胞的增殖情况。胸腺属于中枢免疫器官，是T淋巴细胞分化、成熟的场所，其功能状态直接或间接地决定机体的细胞免疫和体液免疫水平。脾脏属于最大的外周免疫器官。胸腺指数、脾脏指数在一定程度上可作为衡量机内内免疫功能的观察指标[7]。在本研究中，蟾酥水提取物高、中剂量组能显著升高小鼠的胸腺和脾脏指数，表明了蟾酥水提取物能通过升高免疫器官指数而发挥免疫调节作用。

动物机体中各种白细胞是机体防御体系的重要组成部分，具有吞噬异物、产生抗体、治愈机体伤病、抵抗病原体的入侵等作用，是机体防御系统的一个重要组成部分[8]。淋巴细胞是主要的免疫活性细胞，受抗原刺激后能分化增殖，产生特异性免疫应答，参与体液免疫和细胞免疫。单核细胞可通过吞噬、调理抗原而产生抗体等方式，抵御和消灭入侵机体的病原微生物，或者诱导淋巴细胞产生特异性免疫反应[9]。本研究结果显示，蟾酥水提取物能增加小鼠血液总白细胞总数，促进对淋巴细胞的增殖作用尤为明显。另外，蟾酥水提取物能与Con A与LPS的协同作用促进淋巴细胞的体外增殖能力。

在正常生理情况条件下，细胞因子具有免疫调节，具有促进造血、抗病毒等作用，在某些刺激条件或因子作用可介导病理性反应，导致某些病理过程的发生。在不同细胞因子作用下，Th细胞可以分为Thl细胞和Th2细胞亚群[10]。通常情况下，Th1/Th2型细胞因子处于动态平衡。而IFN-γ和IL-4的含量变化可反映Thl细胞和Th2细胞的功能，反映机体的免疫的平衡状态[11]。本研究结果表明，该蟾酥水提取物能促进免疫细胞增值能力，促进脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ，升高小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ细胞因子水平，这种上调作用可能是蟾酥水提取物发挥免疫调节作用的关键因素之一。

于洋等[4]曾用蟾酥注射液(批号为20080501)对小鼠进行免疫影响方面的实验，而本实验对提取工艺进行优化后的蟾酥水提取(批号为20130625)进行了实验小鼠免疫功能方面影响的研究，结果表明了该蟾酥水提取物能明显促进免疫器官脾脏和胸腺的生长，无论是体内还是体外实验，蟾酥水提取物都能明显促进脾淋巴细胞的增殖，上调细胞因子IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的表达，该实验结果与于洋等研究结果相一致[4]。由此可推测，经过优化提取工艺后的蟾酥水提取物并未改变其免疫调节的作用。虽然蟾酥具有很大的潜在药用价值，但因其本身具有一定的毒性作用而使其在应用上受到一定的限制，最近有文献报道蟾酥可能诱导心肌损伤[12]以及通过激活NF-κB(核转录因子κB)信号通路和抑制BDNF(脑源性神经营养因子)的表达引发神经毒性[13],使得蟾酥的提取工艺及其临床应用上还需要更深入的研究。

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(责任编辑：梅 竹)

Effects of water extract of bufonid on immune functions of mouse

LIANG Zheng-ming1,HE Jia-kang1,2,AN Bao-ju1,XU Yang-feng1,NIE Hang-ying1,WEI Ying-yi1

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University, Nanning 530005，China; 2.Engineering Research Center for Veterinary Medicine Preparations in Guangxi,Nanning 530005, China)

The effects of trial production of water extract of bufonid on immune function in mouse in vivo and in vitro were studied.The mice were randomly divided into five group：high (2 mg/kg),middle (1 mg/kg),low (0.5 mg/kg) dosage group of water extract of bufonid,levamisole control group and normal control group in vivo.Mice were given intraperitoneally water extract of bufonid,levamisole and saline for three days.The effects of water extract of bufonid on mice immunocytes were evaluated, the immune organ index,differential leukocyte count,the secretion of IL-2,IL-4,IL-12 and IFN-γ in serum.The spleen lymphocytes of healthy mice were cultured,added different concentrations of water extract of bufonid(20,10,5 μg/ml) and incubated for 48 h,MTT method was used to assess the proliferation ability of spleen lymphocytes,and the concentrations of IL-2,IL-12,IL-4 and IFN-γ in the supernatant of cell culture were measured by ELISA.The experiment results showed that water extract of bufonid markedly enhanced the growth of immune organs,increased the proliferation of spleen lymphocyte and the IL-2,IL-12,IL-4,and IFN-γ secretion.The results indicated that the pilot products of water extract of bufonid could improve immune function by promoting the proliferation of immune cells and immune cytokine secretion.

water extract of bufonid;mouse;immune;organ index;cytokine;proliferation

2016-10-08；

2016-11-07

国家自然科学基金项目(31360624)；广西自然科学基金项目(2014GXNSFAA118115)；广西大学基金(XBZ120918)。

梁正敏(1992-)，女，硕士生，主要从事中兽医药研究。

韦英益(1973-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事动物病理学与免疫病理研究 。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.011

S816.7

A

1003-6202(2017)01-0043-05