蟾酥贮藏期间化学成分的变化

刘京京宋嬿 卞雪莲李冬 郭夫江 吴迎春∗ 李医明∗

（1.上海中医药大学中药学院， 上海201203； 2.上海上药华宇药业有限公司， 上海200082； 3.上海金蟾健康科技有限公司， 上海201906）

蟾酥为传统名贵中药，来源于蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo melanostictusSchneider 的干燥分泌物，其具有很高的医疗价值［1］。蟾酥是麝香保心丸和六神丸等中成药的主要原料，每年的市场需求量非常大，且价格逐年增长，因此在蟾酥的流通和贮藏环节确保其质量稳定非常重要［2⁃4］。2020 年版《中国药典》对蟾酥性状的规定是“呈扁圆形团块状或片状，棕褐色或红棕色，团块状者质坚，不易折断，断面棕褐色，角质状，微有光泽；片状者质脆，易碎，断面红棕色，半透明”［5］。蟾酥中主要活性成分为蟾毒配基类化合物，其含量是评价蟾酥质量优劣的主要标准［6］，药典中规定蟾酥指标成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基三者之和不低于7.0%。

很多中药饮片厂反应蟾酥在贮藏的过程中会发现指标成分含量出现下降的现象，因此考察不同贮藏条件对蟾酥化学成分的变化影响，形成合适的蟾酥贮藏环境标准，可减少中药饮片类企业因贮藏不当导致蟾酥质量下降而造成经济损失［7⁃9］。同时由于蟾酥都是少量多批次收购，且每个批次都需要进行检测，而检测时都需要用到对照品进行对照，这些对照品购买比较昂贵，且需要多次使用，因此如何保存这些对照品溶液也显得非常重要。基于以上原因，有必要对蟾酥及其标准品甲醇溶液在不同贮藏温度下化学成分变化情况进行考察。本研究将同批蟾毒灵甲醇溶液、华蟾酥毒基甲醇溶液和脂蟾毒配基甲醇溶液，同时存放在－18、4、25 ℃环境下，经过连续20 d 的动态观察和测定，记录了其化学成分变化情况，并确定变化产物结构；将同批蟾酥药材存放在－18、4、25 ℃环境下，经过连续24 个月的动态观察和测定，为蟾酥贮藏环节的质量控制提供依据。

1 材料

Agilent Technologies 1260 Infinity 高效液相色谱仪、1260 Infinity Ⅱ半制备液相（美国安捷伦公司）；BT125D 电子天平（德国赛多利斯公司）；SK5200H 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；F／KSWB⁃50L 快速温变试验箱（上海丰实实验仪器有限公司）；Delta series 生物安全柜（美国Labconco 公司）；Sephadex LH⁃20 凝胶（美国Pharmacia 公司）；Bruker Avance 600 核磁共振仪（德国布鲁克公司）；Q⁃TOF⁃Ultima 质谱仪（美国Waters 公司）。

甲醇、乙醇、丙酮为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（德国默克公司）。蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基为蟾酥中分离制备得到，面积归一化法测定质量分数大于98%。蟾酥由上海金蟾健康科技有限公司于2018 年5 月提供，经鉴定为正品。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品25.0 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，精密吸取1 mL，于10 mL 量瓶中定容，摇匀后0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。对照品蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶液质量浓度均为0.5 mg／mL。分别贮藏于－18、4、25 ℃环境中，每隔半个月进行1 次测定。

2.2 色谱条件 Agilent Extend⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.3 % 乙酸（B），梯度洗脱（0～15 min，28%～54% A；15～35 min，54%A）；柱温30 ℃；体积流量0.6 mL／min；检测波长296 nm［10］。

2.3 对照品溶液含量测定 采用外标一点法计算对照品溶液的含量。3 个对照品中蟾毒灵和脂蟾毒配基溶液在不同的贮藏温度下20 d 内含量保持不变，华蟾酥毒基甲醇溶液在4、25 ℃环境下随着时间的延长含量不断下降，结果见图1～2。

图1 不同温度下华蟾酥毒基含量随时间变化Fig.1 Cinobufagin contents under exposure of different temperatures and time length

2.4 华蟾酥毒基分解产物鉴定 制备10 mg／mL华蟾酥毒基溶液，60 ℃下快速产生分解产物，按照“2.2”项下方法制备得分解产物，并通过ESI⁃MS、1H⁃NMR 和13C⁃NMR 测定其化合物结构。

图2 华蟾酥毒基HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of cinobufagin

分解产物为白色不定型粉末，ESI⁃MSm／z：401 ［M＋H］＋，分子式为C24H32O5。1H⁃NMR（600 MHz，MeOD）δ：8.09（1H，brd，J＝9.3 Hz，H⁃22），7.40（1H，dd，J＝9.3，1.5 Hz，H⁃21），6.21（1H，d，J＝1.5 Hz，H⁃21），4.71（1H，dd，J＝9.2，2.1 Hz，H⁃16），4.14（1H，m，H⁃3），3.56（1H，m，H⁃15），2.69（1H，d，J＝9.2 Hz，H⁃17），0.96（3H，s，H⁃19），0.69（3H，s，H⁃18）；13C⁃NMR（150 MHz，MeOD）δ：164.7（C⁃24），152.6（C⁃21），151.9（C⁃22），119.8（C⁃20），113.6（C⁃23），72.5（C⁃14），70.6（C⁃16），69.0（C⁃3），63.2（C⁃15），53.0（C⁃17），44.2（C⁃13），33.6（C⁃8），36.8（C⁃10），41.2（C⁃5），40.8（C⁃12），36.7（C⁃4），25.8（C⁃6），39.7（C⁃9），29.5（C⁃1），34.5（C⁃2），20.1（C⁃7），20.2（C⁃11），22.6（C⁃19），17.6（C⁃18）。以上数据与文献［11］ 报道比对，鉴定化合物为去乙酰华蟾酥毒基。

2.5 供试品溶液的制备 将蟾酥于2018 年5 月10日置于黑色塑料袋中，分别贮藏于－18、4、25 ℃中，测定第0 月含量，之后每3 个月进行外观观察和含量测定。

分别精密称取蟾酥细粉25.0 mg，置于具塞圆底烧瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，置于水浴锅中，待甲醇微沸后，连续回流60 min，放冷，甲醇补足减失质量，精密吸取上清液1 mL，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.6 不同贮藏条件蟾酥外观变化 随着贮藏时间的延长，－18、4 ℃下的蟾酥色泽未见明显变化，质地较硬；25 ℃下的蟾酥贮藏12 个月后颜色变黑，断面失去光泽，质地变软。

2.7 蟾酥含量测定 在“2.2”项色谱条件下测定蟾酥中3 种蟾毒配基类成分含量（图3）。由表1可知，－18 ℃贮藏条件下蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量两年内无变化。4、25 ℃贮藏条件下蟾酥中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总含量逐月下降，4 ℃贮藏12 个月后总含量低于7%；25 ℃贮藏6 个月后总含量低于7%。

表1 蟾酥中成分含量随时间和温度变化Tab.1 Contents variations of B.Venenum constituents due to exposure to different temperatures and time length

图3 不同贮藏时间各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents due to different shelf time

3 讨论

3.1 对照品在贮藏过程中的变化 药典中规定的蟾酥中3 个指标成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基从化合物结构上看都属于甾体类成分，结构相对稳定，而华蟾酥毒基结构中16 位羟基与乙酰基成酯，这一结构在贮藏时受温度的影响比较大，容易发生水解生成去乙酰华蟾酥毒基［12］，从而影响对照品纯度，因此对于需要经常检测蟾酥的科研和企业单位，华蟾酥毒基的对照品溶液需要保存在－18 ℃中，或者每次使用前需重新配制。

3.2 蟾酥贮藏过程中性状和含量变化规律 本研究选用上海崇明地区所产的蟾酥鲜浆，制作成蟾酥成品。样品分别贮藏于－18、4、25 ℃环境下连续观察2年，随着贮藏时间的延长，25 ℃环境下的蟾酥色泽加深，质地变软，外观上已经不符合药典的要求，而－18、4 ℃环境下的蟾酥色泽未见明显变化，质地较硬；－18 ℃环境下蟾酥中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量基本不变；4、25 ℃环境下华蟾酥毒基含量明显下降，在初期3 个指标成分中含量总和为9.7%，而放置6 个月以上则低于《中国药典》规定的7.0 %，质量不合格，其中变化的主要原因是蟾酥中华蟾酥毒基会发生脱乙酰酯降解，而蟾毒灵和脂蟾毒配基含量相对稳定。

3.3 对蟾酥流通环节的建议 蟾酥是传统贵稀中药材，具有良好的强心、抗肿瘤等生物活性，是生产麝香保心丸、六神丸、蟾酥注射液等中成药的重要原料。由于中华大蟾蜍和黑框蟾蜍的动物资源日益减少，而以蟾酥为原料的中药制剂需求却在增加，同时又因蟾酥来源分布较广，很多产地的蟾酥达不到药典规定而被作为不合格产品废弃，导致蟾酥价格在逐年增长，所以蟾酥的加工、贮藏等环节就显得尤为重要，如不能合理地贮藏则可能因发霉变质、含量下降等原因导致产品不合格而造成严重的经济损失。因此，建议企业贮藏蟾酥时选择冷冻、避光的环境。