壳聚糖-银纳米微粒表面修饰木纤维的制备及抗菌性能研究

冯晓燕，郑坤，陈莹∗，王春鹏，储富祥

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

·研究报告——生物质材料·

壳聚糖-银纳米微粒表面修饰木纤维的制备及抗菌性能研究

冯晓燕，郑坤，陈莹∗，王春鹏，储富祥

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

以液相还原法制备了壳聚糖-银纳米微粒(CS-Ag NPs)，并通过γ-巯丙基三甲氧基硅烷作为硅烷偶联剂将其修饰到木纤维表面，获得了具有抗菌性能的CS-Ag NPs表面修饰木纤维。采用透射电子显微镜研究了CS-Ag NPs的形貌；以傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜、热重分析仪等分析手段对CS-Ag NPs表面修饰的木纤维进行了结构形貌以及热稳定性的分析，并讨论了其吸水性能。结果表明表面修饰后的木纤维接枝率为3.06%，具有高热稳定性及低吸水性。通过琼脂板计数法测试了CS-Ag NPs表面修饰前后的木纤维对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽庖杆菌以及革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌的抗菌效果，结果显示表面修饰后的木纤维对实验菌种的抑菌率都在99.0%以上。此外，还研究了未处理、PVP-Ag NPs以及CS-Ag NPs表面处理的木纤维板的抗菌性能，结果表明，在湿热环境下，CS-Ag NPs表面处理的木纤维板到第8天时仍没有霉菌长出，而未处理的木纤维板和传统抗菌剂银纳米微粒处理的木纤维板到第5天时就开始长霉菌，由此可以看出表面修饰CS-Ag NPs的木纤维板具有更好的抗菌效果。

银纳米微粒；木纤维；抗菌

木纤维是一种来源丰富的天然纤维，主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素[1]。由于木纤维具有可再生、可生物降解、安全无污染等优点，在家具、地板、汽车、服装等领域得到了广泛应用[2-3]。但是因为木纤维表面含有羟基等大量亲水性基团，在高温湿热环境中极易吸湿，进而导致其表面霉菌滋生，出现发霉腐蚀等现象，限制了木纤维在应用领域的进一步发展[4]。目前主要使用的木纤维类抗菌防腐剂是有机化合物类和无机硼类，此类抗菌防腐剂虽然能有效抑制霉菌生长，但在使用过程中较易流失，并会对环境和人体健康产生危害[5-6]。因此，开发低毒、高效、环保的木纤维抗菌剂成为其应用领域的一个重要发展方向。银系化合物是常见的抗菌材料，相关研究表明银纳米材料具有抗菌广谱性、持久性和不产生耐药性等优点[7-8]。近年来，研究发现以壳聚糖为保护剂的壳聚糖-银纳米微粒，不仅可以增加银纳米微粒在水溶液体系中的稳定性，而且壳聚糖与银纳米微粒的协同抗菌效应有效增强了其抗菌性[9]。同时，生物质材料壳聚糖是一种环境友好的聚合物，具有生物可降解、安全无毒等特点[10-12]。因此，许多研究将壳聚糖-银纳米抗菌剂逐渐应用于纤维抗菌领域，但未见在木纤维抗菌领域的报道。本研究采用液相还原法制备了壳聚糖-银纳米微粒(CS-Ag NPs)并将其修饰到木纤维表面，得到具有抗菌效果的木纤维；研究中测试了CS-Ag NPs表面修饰的木纤维对耐药性细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌的抗菌效果，并讨论了CS-Ag NPs表面修饰的木纤维板的抗菌性能，以期为改善木纤维的吸湿发霉问题提供一些参考。

1 实验

1.1 试剂与仪器

壳聚糖(M n＝100000～300000)，北京百灵威科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)、硝酸银、硼氢化钠、γ-巯丙基三甲氧基硅烷、三水合柠檬酸钠，均为分析纯。杨木纤维，密度为0.81 g/cm3，工业级；木纤维板，由杨木纤维直接胶合压制而成，然后裁成6 cm×5 cm×1.25 cm大小。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CICC 10384)、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus(CICC 10352)、革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌Escherichia coli(CICC 10354)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。耐药性细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)，由南京市鼓楼医院提供。细菌培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基和琼脂培养基，使用前灭菌处理。

OPTIMA7000电感耦合等离子体发射光谱仪(Leeman，美国)、TEM-1010透射电子显微镜(JEOL，日本)、S-3400N扫描电子显微镜(Hitachi，日本)、Nicolet iS10红外光谱仪(PittCon，美国)、NETZSCH 209F热重分析仪(耐驰，德国)、ChroMat4300酶标仪(Molecular Devices，美国)。

1.2 样品制备

1.2.1 壳聚糖-银纳米微粒(CS-Ag NPs) 以液相还原法制备CS-Ag NPs。具体操作为取10mg壳聚糖溶于20mL体积分数为1%的无水乙酸的水溶液中，得到质量浓度为0.5g/L的壳聚糖乙酸溶液，室温及磁力搅拌条件下，加入200μL 0.1mol/L硝酸银溶液。10min后，向上述溶液中逐滴加入50μL 0.1mol/L硼氢化钠溶液，混合溶液颜色逐渐由无色变为橙红色，待颜色稳定后，得到CS-Ag NPs溶液(电感耦合等离子体发射光谱仪测得银纳米微粒质量浓度为24.8mg/L)，待用。

1.2.2 聚乙烯吡咯烷酮-银纳米微粒(PVP-Ag NPs) 在40℃水浴和搅拌条件下，取2mmol/L的硝酸银溶液和4mmol/L的三水合柠檬酸钠溶液各12.5mL，混合，然后加入25mL质量浓度2 g/L的聚乙烯吡咯烷酮溶液，反应15min后，逐滴滴入0.3mL 0.1mol/L的硼氢化钠溶液，溶液颜色逐渐由无色变成橙黄色，颜色稳定后，即得到PVP-Ag NPs。

1.2.3 表面修饰木纤维的制备 配制30mL体积分数为4%的γ-巯丙基三甲氧基硅烷(硅烷偶联剂)的甲苯溶液，加入2g左右的木纤维，50℃恒温反应6h，无水乙醇洗涤3次，120℃烘干，然后浸入上述制备的CS-Ag NPs或PVP-Ag NPs溶液中，50℃水浴中静置12 h，蒸馏水洗涤3次并120℃烘干，待用。

1.3 样品表征

采用透射电子显微镜(TEM)对制备的CS-Ag NPs进行形貌表征；采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对未处理的木纤维和CS-Ag NPs表面修饰的木纤维结构进行表征，测试范围为500～4000 cm-1；微观形貌采用扫描电子显微镜(SEM)表征；热稳定性利用热重分析仪(TG)进行分析，空气流，升温速率为10K/min，温度范围室温～800℃，样品质量为3～5mg。

1.4 样品测试

1.4.1 接枝率计算 CS-Ag NPs表面修饰木纤维的接枝率由式(1)计算:

式中:Y—样品接枝率，%；m1—接枝前木纤维的质量，g；m2—接枝后木纤维的质量，g。

1.4.2 吸水率测试 分别取约0.50 g未处理和CS-Ag NPs表面修饰的木纤维数份，各自浸于15mL蒸馏水中，室温下静置一定时间(0、5、10、15、20、25、30、35、40min)，然后将其取出拧干至无水滴，称质量为m3；置于80℃恒温箱中干燥后，称其质量为m4。利用式(2)计算吸水率:

式中:w—样品吸水率，%；m3—吸水后木纤维的质量，g；m4—烘干后木纤维的质量，g。

1.4.3 最低抑菌浓度的测试 CS-Ag NPs溶液放入截留分子量为3 500的透析袋后置于蒸馏水中透析以除去溶液中残留的Ag＋，48 h后，以透析后的溶液配制银纳米微粒质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4和12.8mg/L的溶液各2mL。配制上述浓度的PVP-Ag NPs及壳聚糖溶液各2mL。选取新鲜革兰氏阳性菌S.aureus和革兰氏阴性菌E.coli溶液稀释至106个/mL，在96孔板各孔中分别加入100μL菌液，然后加入上述配制的各浓度的溶液100μL，并设置加菌液和100μL的无菌蒸馏水的组别作为空白对照组。每个浓度的样品做3个平行样，混合均匀后，37℃恒温培养18 h后，酶标仪测各溶液在600 nm处的吸光度(OD600nm)。同时，对培养后的溶液进行观察，以溶液透明不再浑浊处对应的样品浓度标定最低抑菌浓度值。

1.5 抗菌实验分析

1.5.1 CS-Ag NPs表面修饰木纤维的抗菌实验 待测菌株(MRSA、S.aureus、B.cereus、E.coli)分别稀释至108个/mL，各取1mL，然后分别加入约0.050g CS-Ag NPs表面修饰的木纤维，同时以未修饰的木纤维作为空白对照组，混合均匀后37℃恒温培养4h，取出木纤维，洗脱细菌，取0.5mL菌液均匀涂布到琼脂板上，37℃恒温培养18 h后数琼脂板上长出的菌落。抑菌率由式(3)计算:

式中:R—样品的抑菌率，%；A—实验组的菌落数；B—空白对照组的菌落数。

1.5.2 表面修饰木纤维板的抗菌实验 将2mL体积分数为4%的γ-巯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液喷洒其表面对其进行表面处理，待溶液全部润湿于木纤维板表面后，120℃烘干。再用3mL CS-Ag NPs(或PVP-Ag NPs)溶液浸泡，50℃下反应10 h，蒸馏水洗涤3次，120℃烘干，待用。以未表面处理的木纤维板为对照组，将其与处理过的木纤维板分别置于温度为30℃的潮湿环境下，一段时间后，观察木纤维板表面的细菌生长情况。

2 结果与讨论

2.1 CS-Ag NPs修饰木纤维机理推测

可能的表面修饰过程如下:首先，将木纤维浸于硅烷偶联剂(γ-巯丙基三甲氧基硅烷)的甲苯溶液中，在此过程中，硅烷偶联剂上的硅氧烷基与木纤维的羟基发生偶合反应，使硅烷偶联剂接枝到木纤维上；然后，将处理后的木纤维浸于CS-Ag NPs溶液中，由于硅烷偶联剂另一端为巯基，比较容易与银纳米微粒结合，经过一定时间的反应，最终得到表面接枝CS-Ag NPs的木纤维。通过计算得到木纤维上CS-Ag NPs的接枝率约为3.06%

2.2 样品的结构及热性能分析

2.2.1 CS-Ag NPs的形貌分析 用透射电镜对制备的CS-Ag NPs进行了形貌表征，结果如图1所示，从图中看出CS-Ag NPs基本呈球形，大小分布较为均匀，计算得出CS-Ag NPs的平均粒径约为20 nm。

2.2.2 木纤维的FT-IR分析 通过硅烷偶联剂的化学偶联作用将得到的CS-Ag NPs表面修饰到木纤维表面，获得具有抗菌性能的木纤维，利用FT-IR对CS-Ag NPs修饰前后的木纤维进行表征，结果如图2所示，比较二者的光谱曲线，修饰前后木纤维的红外光谱图大致相似，3300 cm-1左右为木纤维中羟基的O—H伸缩振动峰；表面修饰后的木纤维在2916.61 cm-1处甲基(—CH3)的吸收峰红移至2888.81 cm-1，这可能是由于壳聚糖分子六元环中亚甲基(—CH2—)的C—H的伸缩振动引起的；未处理木纤维中1030 cm-1处的吸收峰为C—O—C中C—O的伸缩振动，表面修饰后由于引入了Si—O—C的结构，此峰蓝移到1057 cm-1附近。

图1 CS-Ag NPs的透射电镜图片Fig.1 TEM image of CS-Ag NPs

图2 木纤维处理前(a)后(b)的红外光谱对比Fig.2 FT-IR spectra of wood fiber before(a) and after(b)m odification w ith CS-Ag NPs

2.2.3 木纤维的SEM表征 利用扫描电镜对表面修饰前后的木纤维进行表面形貌表征，如图3所示，未处理的木纤维表面较为光滑，并附着一些小的碎片，可能是木纤维吸附的杂质等；表面修饰后的木纤维表面被一层凹凸不平的膜覆盖，并有小部分CS-Ag NPs集聚，这可能是CS-Ag NPs和偶联剂共同产生的复合物层。

图3 木纤维经CS-Ag NPs处理前后的扫描电镜图Fig.3 SEM images of wood fiber before and after modification w ith CS-Ag NPs

2.2.4 木纤维的TG分析 图4为CS-Ag NPs表面修饰前后的木纤维在空气流中的热重分析曲线。

图4 木纤维经CS-Ag NPs处理前后的热重图Fig.4 TG/DTG curves of wood fiber before and after modification w ith CS-Ag NPs

如图所示，木纤维失重可以分成3个阶段，第一阶段室温～120℃是木纤维中水分的蒸发，失重率约为5%；此后，在升温到230℃过程中木纤维的质量基本不变；第二个阶段为230～400℃，未处理的木纤维起始分解温度为230.7℃，而经CS-Ag NPs表面修饰的木纤维的起始分解温度升至244.8℃，这可能是由于表面覆盖的壳聚糖(热分解温度290℃左右[13])致使修饰后的木纤维起始分解温度升高，使木纤维具有更好的热稳定性，这个阶段木纤维的质量迅速降低，主要是由于半纤维素和部分纤维素的分解；最后一个阶段为400～550℃，主要是木纤维中纤维素结晶区部分降解和木质素的热解。另外，从图中还可以看出，CS-Ag NPs表面修饰的木纤维与未处理的木纤维相比，初始分解温度较高且热解速率也偏高；未处理木纤维最终残留量为2.95%，而CS-Ag NPs表面修饰的木纤维的最终残留量为6.22%，这可能是由于表面修饰的银纳米微粒不发生分解，留在残余的木纤维中引起的。

2.2.5 木纤维吸水性能分析 由于木纤维分子结构中含有大量的羟基，在潮湿和高温环境中极易吸湿，进而导致细菌滋生，限制了其在湿热条件下的应用。因此，对CS-Ag NPs表面修饰前后的木纤维的吸水性进行测定，结果如图5所示。从图5中可以看出，CS-Ag NPs表面修饰的木纤维的吸水率达到平衡时约为305%，低于未处理的木纤维(402%)，这主要是由于硅烷偶联剂和纳米银微粒的引入，导致木纤维表面的羟基含量减少以及表面形貌发生变化，使其吸水率下降[14]。

图5 木纤维经CS-Ag NPs修饰前后的吸水性对比Fig.5 W ater absorption ratio of wood fiber before and after modification w ith CS-Ag NPs

2.3 表面修饰样品的抗菌性能研究

2.3.1 CS-Ag NPs的抑菌性能 为研究表面修饰CS-Ag NPs木纤维的抗菌性能，首先测定了CS-Ag NPs对革兰氏阳性菌S.aureus和革兰氏阴性菌E.coli的最低抑菌浓度，同时比较了CS-Ag NPs、传统PVP制备的银纳米微粒PVP-Ag NPs及壳聚糖对2种菌种的抗菌性能，结果如图6所示。不同银纳米微粒浓度的PVP-Ag NPs和CS-Ag NPs对上述2种菌种都有抑制效果，并且随着银纳米微粒浓度的增加，抑菌效果增强；CS-Ag NPs溶液对S.aureus和E.coli的最低抑菌质量浓度均为0.2mg/L，而PVP-Ag NPs 对2种菌的最低抑菌质量浓度分别为0.8和1.6mg/L，并且在0～0.8mg/L时，CS-Ag NPs的抑菌率高于PVP-Ag NPs的，这可能是由于壳聚糖具有生物相容性且本身有一定的抗菌效果，与银纳米微粒复合时对细菌的抑制能力更强，而PVP只具有稳定银纳米微粒的作用。此外，实验数据表明壳聚糖对这2种菌种都有微弱的抑菌能力，这与文献表明壳聚糖具有一定的抗菌效果相符[15-16]。因此，研究表明CS-Ag NPs具有更强的抑菌效果，且壳聚糖与银纳米微粒可能存在一定的协同抗菌作用。

图6 样品对S.aureus(a)和E.coil(b)的抑菌率Fig.6 The inhibitory rates of sam p les against S.aureus(a)and E.coli(b)

2.3.2 木纤维的抗菌性能 以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽庖杆菌、革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为测试菌，研究了CS-Ag NPs表面修饰前后的木纤维的抗菌效果。图7(a～d)为未处理木纤维和CS-Ag NPs表面修饰的木纤维浸入各菌液一段时间后，洗脱表面细菌再培养后的琼脂板照片，从图中可以看出，未处理木纤维对各菌种皆无抗菌效果，该组的琼脂板都被观察到有大量的菌斑，另一方面，CS-Ag NPs表面修饰的木纤维组的琼脂板几乎没有(或几个)菌斑出现，证实了表面修饰后的木纤维有广谱的抗菌效果。利用琼脂板计数法统计了CS-Ag NPs表面修饰木纤维对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽庖杆菌、革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌的抑菌率，分别是99.0%、99.0%、99.9%、99.5%，未表面修饰的木纤维对细菌几乎没有抑制作用。

图7 抗菌实验对比效果图Fig.7 The images of antibacterial activities

2.3.3 木纤维板的抗菌性能 高密度纤维板是以木质纤维为原料，施加脲醛树脂在加热加压的条件下压制成的一种板材，广泛应用于地板、护墙板、墙板、家具等室内装潢材料，但目前仍存在湿热环境中易发霉的缺点。以 CS-Ag NPs溶液直接表面处理木纤维板，比较了其与未处理的木纤维板以及PVP-Ag NPs溶液表面处理的木纤维板的抗菌效果。分别将未处理的木纤维板、PVP-Ag NPs溶液表面处理的木纤维板和CS-Ag NPs溶液表面处理木纤维板置于30℃潮湿环境下，静置一段时间(2 d、5 d和8 d)后，观察3块木纤维板的表面细菌生长情况。图8为不同静置时间记录的木纤维板照片。如图8所示，第2天时，3种木纤维板表面均无菌斑长出；第5天时，未处理的木纤维板表面已有较多的菌斑出现，PVP-Ag NPs处理的木纤维板也开始出现少量菌斑，而经CS-Ag NPs表面处理的木纤维板表面尚未出现菌斑；到了第8天，CS-Ag NPs表面处理木纤维板表面仍未有菌斑出现，此时，未处理的木纤维板表面几乎布满菌斑，而PVP-Ag NPs处理的木纤维板也有很多菌斑出现。结果表明，与PVP-Ag NPs相比，CS-Ag NPs表面处理的木纤维板具有更好的抗菌性和持久的抗菌效果，这可能是由于壳聚糖与银纳米微粒之间存在协同抗菌效应。此外，表面处理过程中引入硅烷偶联剂，使木纤维的吸水性下降，不易在潮湿环境下吸水，也是CS-Ag NPs表面处理的木纤维板抗菌性能提高的原因之一。

图8 木纤维板表面处理前后的抗菌效果图Fig.8 Images of antibacterial activity of modified wood fiber boards

3 结论

3.1 以液相还原法制备了壳聚糖-银纳米微粒(CS-Ag NPs)，得到的CS-Ag NPs基本呈球形，粒径约为20 nm，通过γ-巯丙基三甲氧基硅烷作为硅烷偶联剂将其表面修饰到木纤维表面，获得了具有抗菌性能的CS-Ag NPs表面修饰的木纤维，接枝率约为3.06%，通过表征发现木纤维表面被覆盖一层凹凸不平的膜，热稳定性提高且吸水性能下降。

3.2 对CS-Ag NPs以及表面修饰前后的木纤维的抗菌性能进行了研究，结果表明CS-Ag NPs对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的最低抑菌质量浓度均为0.2mg/L，抑菌效果优于PVP-Ag NPs。CS-Ag NPs表面修饰木纤维对耐药性细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽庖杆菌、革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌的抑菌率分别是99.0%、99.0%、99.9%、99.5%。

3.3 对未处理、PVP-Ag NPs和CS-Ag NPs表面处理的木纤维板的抑菌性能进行研究，结果表明:与未处理的木纤维板及PVP-Ag NPs表面处理的木纤维板相比，CS-Ag NPs表面处理的木纤维板具有更强的抗菌效果和更持久的抗菌能力。

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Preparation and Antibacterial Activity ofWood Fiber Modified with Chitosan-Ag Nanoparticles

FENG Xiaoyan，ZHENG Kun，CHEN Ying，WANG Chunpeng，CHU Fuxiang

(Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF；National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization；Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering，SFA；Key Lab.of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province，Nanjing 210042，China)

Chitosan-Ag nanoparticles(CS-Ag NPs)were prepared by liquid phase reducingmethod and then modified on the wood fiber withγ-mercaptoproyl trimethoxysilane as coupling agent to obtain the antibacterial wood fiber.Themorphology of CS-Ag NPs was analyzed by TEM.The morphology and chemical structure as well as the thermal stability of the modified wood fiber were characterized by FT-IR，SEM and TG.Moreover，the water absorbency of thewood fiberwas explored.The results indicated that the modified wood fiber showed high thermal stability and low water absorbency.The antibacterial effects of the wood fiber against methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)，gram-positive bacteria Staphylococcus aureus，Bacillus cereus and gram-negative bacteria Escherichia coli were studied with AGAR plate countingmethod.It showed that the inhibitory rates of themodified wood fiber against the bacteria were all up to 99.0%.Furthermore，the antimicrobial properties of the wood fiber board treated with PVP-Ag NPs and CS-Ag NPswere investigated.It indicated that thewood fiber board treated with CS-Ag NPs did not find bacterial plaque at8th daywhile the fibers treated with PVP-Ag NPs and untreated found the plaque at5th day in hygrothermal environment. The results illustrated that the wood fiber board treated with CS-Ag NPs possessed greater antibacterial properties.

Ag nanoparticles；synergetic antimicrobial；wood fiber

TQ351.01＋3

A< class="emphasis_bold">文献编号:1

1673-5854(2017)01-0001-07

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.01.001

2016-03-24

江苏省生物质能源与材料重点实验室基本科研业务费项目(JSBEM-S-201503)；江苏省自然科学基金项目(BK20131071)

冯晓燕(1987—)，女，山东潍坊人，硕士生，主要从事抗菌材料的研究工作

∗通讯作者:陈莹，副研究员，硕士生导师，主要从事天然高分子纳米材料的合成、表征和性能研究；E-mail:yingchencaf＠gmail.com。