人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定

王绍清 王俊平 徐凤琳 艾中伟 刘 婷

(齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定

王绍清 王俊平 徐凤琳 艾中伟 刘 婷

(齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 构建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表达载体,并在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞鉴定其转染及基因沉默效果。方法 应用基因工程技术，构建4条针对PETA-3基因的RNAi靶序列，分别与慢病毒载体PgLV3连接，构建重组慢病毒表达载体PETA-3-shRNA-1～4；将连接产物转化到Top10感受态细胞，经筛选阳性克隆、测序鉴定。应用脂质体法转染293FT细胞，进行病毒包装及滴度测定。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染MCF-7细胞，实时定量PCR和Western印迹检测MCF-7细胞PETA-3 mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果，选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致，感染MCF-7细胞96 h后，PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降，其中mRNA表达下降85%，蛋白表达下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/ml。结论 成功构建针对PETA-3基因的慢病毒载体PETA-3-RNAi-LV3，体外感染MCF-7细胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表达。

PETA-3/CD151；RNA干扰；慢病毒；乳腺癌

四次跨膜结构家族(TM4SF)是抑癌基因家族。它参与其他细胞表面分子之间的连接信号传导，在调节细胞增殖和激活，调节细胞黏附活力中起重要作用。该家族已检测有20多个成员，包括MRP-1/CD9、TAPA-1/CD81、ME91/CD63及KAI1/CD82等。KAI1/CD82等已被认为是抑癌基因产物，与肿瘤进展、预后呈负相关〔1～3〕。而PETA-3/CD151作为TM4SF中新近发现的成员，被认为是TM4SF中的癌基因，能与其他跨膜四蛋白超家族成员和(或)整合素等结合形成复合体,通过蛋白激酶C、磷脂酰肌醇4激酶等信号通路将胞外信号转导入胞内,从而介导细胞的黏附、迁移及血管形成,促进肿瘤细胞侵袭和转移，与肿瘤进展及预后呈正相关〔4,5〕。……