结核分枝杆菌Rv3245蛋白抗原免疫学特性的研究①

王 倩 罗 微 屈子璐 陈铁龙

(天津市海河医院病理科，国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室，天津300350)

结核分枝杆菌Rv3245蛋白抗原免疫学特性的研究①

王 倩 罗 微②屈子璐③陈铁龙④

(天津市海河医院病理科，国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室，天津300350)

目的：研究结核分枝杆菌Rv3425蛋白免疫学特性，评估其诊断应用价值及在结核致病性中的作用。方法：将Rv3425基因克隆至pET28a载体中，诱导表达Rv3425融合蛋白并进行纯化；利用ELISA、Western blot分析其抗原性与特异性；流式检测该抗原对巨噬细胞凋亡的影响。结果：获得了可溶性原核表达融合蛋白Rv3425，Rv3425蛋白能刺激灭活结核分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生高水平的特异性IFN-γ、纯化的Rv3425蛋白能与结核感染小鼠血清特异性结合，其特异性血清抗体IgG及IgM在结核病人中的水平明显高于健康人，发现该蛋白能诱导巨噬细胞的凋亡。结论：本研究发现结核分枝杆菌Rv3425蛋白具有较强的抗原性且能促进巨噬细胞的凋亡，这些发现对于结核病的诊断及致病机制的研究具有重要价值。

结核分枝杆菌；Rv3425；抗原性；巨噬细胞；凋亡

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染而引起的重大传染性疾病。据世界卫生组织2015年结核病最新流行病学调查显示，全球每年约960万的新增病例和150万的死亡病例，全球1/3的人感染过结核，其中90%～98%为潜伏感染，其中2%～10%会发展为活动性结核[1]。基因组学研究发现，结核分枝杆菌基因组中一些片段在牛分枝杆菌或卡介苗(Bacillus calmette guerin,BCG)基因组中缺失，这些片段被称为差异区域(Region of differences,RD)，已有研究报道证实结核疫苗BCG在冻干技术尚未发明之前的传代保存过程中相对于结核分枝杆菌来说丢失了16个区域[2]，这导致现有的BCG的保护力已大大下降，仅对婴幼儿具有保护作用，在成年人中保护力低下。目前，RD区的研究已引起重视，结核分枝杆菌RD1区的“明星蛋白”CFP-10、ESAT6已被成功应用于临床诊断与预防性疫苗的研发[3,4]。后续研究也逐渐发现了其他抗原性及免疫原性较强的RD蛋白诸如RV3873、Rv0222、Rv2645等，RD11区的Rv3425也逐步引起关注，被发现具有较强的免疫原性[5-9]。为更深入探究Rv3425蛋白作为抗原的免疫学特异性，本研究将通过分子生物学手段克隆表达Rv3425蛋白并考察其在结核病诊断中的应用价值，同时探讨它对巨噬细胞凋亡的影响从而初步探讨其在结核病致病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 pET28a原核及pcDNA3.1真核表达质粒由本实验室保存，灭活结核分枝杆菌(iH37Rv，ATCC25618)及其基因组、BCG(ATCC35734)菌株、大肠杆菌感受态DH5α及BL21(DE3)、RAW264.7细胞系(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系)由本实验室保存。27只6～8周龄雌性BALB/c小鼠购于武汉大学动物实验中心，100份结核病人(具有结核病临床症状、临床T-spot检测阳性、痰培养阳性患者)血清由天津市海河医院提供，100份健康人(无结核病临床症状、PPD实验阴性且无其他相关疾病的健康体检人群)血清由天津医科大学总医院检验科提供。PCR引物由英骏公司合成，BamHⅠ及HindⅢ限制性内切酶购于Promega公司，高效T4连接酶购自TOYOBO公司，Ni-NTAAgarose购自QIAGEN公司，咪唑购自Sigma公司，IFN-γELISA检测试剂盒购自于北京达科为公司，细胞培养基RPMI1640及DMEM培养基购自Hyclone公司，His-Tag鼠多克隆抗体、Myc-标签鼠多克隆抗体购自于Sungene公司，HRP-羊抗鼠IgG抗体购自Affinity公司，HRP-羊抗人IgG、IgM抗体购自于CoWin公司，结核菌素纯蛋白衍生物PPD购自于北京祥瑞生物制品有限公司，NeofectTMDNA转染试剂购自于零客创智(北京)生物技术有限公司，PI/AnnexinV凋亡检测试剂盒购自于联科生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 根据Pubmed网站Genbank报道H37Rv菌株Rv3425基因编码序列及pET28a质粒上限制性内切酶位点设计特异性引物，引物两端分别引入BamHⅠ及HindⅢ限制性内切酶位点。上游引物P1：5′GCGGATCCATGCATCCAATGAT-ACC3′；下游引物P2：5′TTGAAGCTTCCCGCCCCT-GTAG ATC3′(下划线部分为所加酶切位点)。因pcDNA3.1上多克隆位点上也含BamHⅠ及HindⅢ且编码方向同pET28a，因而构建真核表达重组质粒的引物同上所述。

1.2.2pET28a-Rv3425重组质粒的构建 以H37Rv基因组为模板，PCR法扩增获取Rv3425基因序列，PCR产物BamHⅠ及HindⅢ限制性内切酶双酶切后回收，以高效T4连接酶将其克隆至原核表达质粒pET28a上，连接产物转化DH5α感受态扩增提质粒后用BamHⅠ及HindⅢ酶进行双酶切鉴定，双酶切鉴定结果正确者送予英骏公司测序。

1.2.3Rv3425融合蛋白的表达、纯化与鉴定 将测序结果正确的pET28a-Rv3425质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，在含有卡那霉素抗性的LB固体培养上挑取阳性克隆并转移至YT液体培养基中，37 ℃振摇培养至OD600达0.5左右，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG进行诱导表达，温度28 ℃，时间10h。离心收集沉淀PBS洗涤2次后超声破碎，碎菌后离心8 000r/min30min弃碎菌沉淀，于上清中加入Ni-NTAAgarose冰上结合1h。1h后1 000r/min离心，收集Ni-NTAAgarose，梯度浓度的咪唑缓冲液20、40、80、100mmol/L洗涤结合后的Ni-NTAAgarose，收集洗涤液并作12%浓度的SDS-PAGE检测，最纯的Rv3425蛋白用PolymyxinB-agarose试剂盒去内毒素，于4 ℃层析柜中透析后以BCA蛋白浓度检测法测量Rv3425蛋白浓度，取0.5μg的Rv3425蛋白作利用His标签鼠多克隆抗体及羊抗鼠抗体作Westernblot鉴定。

1.2.4IFN-γ释放水平的检测 将27只BALB/c小鼠随机分为3组，每组作PBS、BCG、iH37Rv免疫。H37Rv及BCG菌株65 ℃水浴1h灭活后(iH37Rv)尾静脉注射进行预免疫。初次免疫剂量为1×108，逐日递加1×108，连续免疫7次，间隔7d后进行实验[7]。处死小鼠取脾脏细胞，用1640培养基制备细胞悬液浓度为1×106个/ml。按100μl/孔的量接种细胞到IFN-γ抗体预包被的ELISA板中培养，各免疫组9只小鼠的脾脏细胞随机分为3份，用PBS(阴性对照)、PPD及Rv3425蛋白刺激，其中PPD及Rv3425的刺激终浓度为1μg/ml。将加入刺激蛋白的细胞置于细胞培养箱中培养37 ℃、24h后按达科为IFN-γELISA检测试剂盒说明书完成检测步骤。

1.2.5 融合蛋白Rv3425血清抗体的Westernblot(WB)鉴定 取纯化的Rv3425融合蛋白稀释成1mg/ml母液，各取5μl与上样Buffer混合煮沸变性5min后进行12%浓度SDS-PAGE，再转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1h后，依次以上文中各免疫组小鼠的血清(1∶200稀释)、TBST洗涤、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体37 ℃孵育1h，TBST再次洗涤后ECL法显色。

1.2.6 结核病人血清Rv3425特异性抗体IgG及IgM的检测 调整Rv3425蛋白浓度10μg/ml，包被96孔板，100μl/well，4 ℃过夜后PBS洗涤2次，扣干。2%的BSA封闭，200μl/孔，37 ℃孵育1h，PBS洗涤2次，扣干。TB病人血清1∶200稀释，100μl/孔，37 ℃孵育1h，PBST洗涤5次，扣干。加入各HRP-羊抗人IgG、IgM、IgG2、IgG4抗体(稀释比按各自说明书进行)，37 ℃孵育1h，PBST洗涤5次，扣干。PBST洗涤5次，扣干。加入TMB显色液100μl/孔，室温显色10～20min。终止反应：50μl/孔加入2mol/L的H2SO4来终止反应。读板：终止后10min内，450nm波长检测其吸光度。以健康人血清作为阴性对照。

1.2.7Rv3425蛋白对巨噬细胞凋亡作用的检测RAW264.7细胞用DMEM培养基接种于6孔板中，1×106个细胞/孔；12h后待细胞生长至对数期(细胞约占视野70%左右时)，将细胞分组，组别为不作转染、转染pcDNA3.1空载质粒及pcDNA3.1-Rv1768重组质粒，转染步骤按NeofectTMDNA转染试剂说明书进行。转染72h后用预冷PBS将细胞反复冲洗并收集(未脱落的细胞用细胞刮轻轻刮拭冲洗下来，动作轻柔勿刮伤细胞)。各组取约105个细胞用细胞裂解液裂解后作myc标签抗体的Westernblot检测，检测转染后观察在分子量大小为20kD左右的Rv3425融合蛋白是否表达；剩下的细胞用PI/AnnexinV试剂盒按说明书染色处理后作FCM检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计分析，以P<0.05为有统计学差异；结果中的ROC曲线及Cutoff值由GraphPadPrism软件生成。

2 结果

2.1pET28a-Rv3425重组质粒的构建及其蛋白的表达与纯化 重组质粒pET28a-Rv3425的BamHⅠ及HindⅢ双酶切鉴定结果如图1A所示，双酶切结果初步证实构建成功。咪唑洗脱纯化蛋白后，其相应的表达及洗脱纯化蛋白的SDS-PAGE结果如图1B所示，发现Rv3425诱导后表达量高，在100mmol/L咪唑洗脱时能获取纯度较高的蛋白。纯化Rv3425蛋白上融合了pET28a质粒上的His标签，可利用His标签抗体作WB鉴定，结果进一步证实了Rv3425蛋白的成功表达，如图1C所示。

2.2 结核感染小鼠中存在高水平的Rv3425特异性IFN-γ及血清抗体 在各免疫组小鼠的IFN-γ释放水平的ELISA检测结果中，我们发现Rv3425能刺激iH37Rv免疫的小鼠产生高水平的IFN-γ，然而在BCG、PBS等对照组小鼠中并未检测到Rv3425能刺激产生高水平的IFN-γ，如图2A所示。WB结果证实结核免疫组小鼠中存在Rv3425特异性血清抗体IgG，而BCG及PBS免疫组未能检测到，如图2B所示。这些结果进一步证实了Rv3425是结核分枝杆菌特有抗原，在BCG中发生了缺失。

2.3 结核病人中Rv3425血清特异性抗体IgG及IgM明显高于健康人 在100例结核病人及健康人Rv3425血清特异性抗体的IgG及IgM的检测中，我们发现结核病人相对于健康人来说其水平明显高于健康人，且具有统计学差异。其中IgG检测的cutoff值为0.68，其ROC图曲线下面积AUC为0.86；IgM检测的Cutoff值为0.41，其ROC图曲线下面积AUC为0.79，如图3所示。根据其Cutoff值判读阴阳性后计算相应的灵敏度与特异度结果，其中IgG分别为78%与79%；IgM分别为73%与75%(图中未显示)。这些结果提示，Rv3425血清特异性抗体IgG与IgM的检测可作为结核病的辅助诊断手段。

图1 Rv3425蛋白的表达及鉴定Fig.1 Expression and identification of Rv3425Note: A.Double enzyme digestion of pET28a-Rv3425,"p" and "i" represent post-induced,"c"represents the control of pre-induced;B.Purification and SDS-PAGE of Rv3425;C.Western blot identification of Rv3425.

图2 Rv3425小鼠特异性IFN-γ及血清抗体的检测Fig.2 Detection of specific IFN-γ and serum antibody in miceNote: A.Detcetion of specific IFN-γ in different groups of mice by ELISA;B.Detcetion of Rv3425 specific IgG in different groups by Western blot.

图3 结核病人与健康人群中Rv3425特异性血清抗体IgG、IgM水平Fig.3 IgG and IgM antibodies responses to Rv3425

图4 Rv3425诱导巨噬细胞凋亡Fig.4 Rv3425 induced apoptosis of macrophageNote: A.Identification of pcDNA3.1-Rv3425 by double enzyme digestion；B.Identification of transfection by Western blot method；C.Detection of RAW264.7 cells apoptosis by FCM method.

2.4 Rv3425能诱导巨噬细胞的凋亡 将Rv3425基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1上(如图4A所示)，进一步测序成功后将质粒瞬时转染至RAW264.7细胞，72 h后鉴定WB鉴定是否表达，结果显示转染后表达成功，如图4B所示。巨噬细胞的凋亡检测流式结果图发现，转染pcDNA3.1-Rv3425重组质粒的较转染空载pcDNA3.1及未作转染的RAW264.7细胞凋亡的比例明显增多(流式图右上象限凋亡细胞比例高达30%)，其典型流式图如图4C所示。

3 讨论

目前，结核病的诊断技术仍需要改进。结核病的临床诊断技术主要以传统的结核菌素(PPD)皮肤试验、抗酸染色、细菌培养为主。这些技术仍存在一定的局限性，如PPD试验的假阳性高，无法区别结核感染与BCG接种；抗酸染色灵敏度低；细菌培养周期长且易污染。后续研发的以RD1区CFP10与ESAT6为刺激抗原的Quanti-FERON-TB Gold In-Tube a及T-SPOT.TB检测法能将灵敏度提升至80%以上[3]，但仍存在一定程度的漏检[10,11]。总的来说，单个或少数联合的抗原靶标已不能满足TB的检测，这是目前抗体检测、IFN-γ检测灵敏度有待提高的原因，联合抗原无论对于血清抗体还是细胞免疫水平的检测都至关重要[12]。因此，筛选新的、抗原性较强的结核特异性蛋白对于结核病的研究至关重要。

本研究对已有报道的RD区蛋白Rv3425的抗原免疫学特性进行了更深入的评估，结果显示Rv3425蛋白是结核分枝杆菌特异性蛋白，能刺激感染小鼠的IFN-γ水平高表达，其刺激效果不亚于结核菌素PPD，如图2A所示。PPD作为临床上结核病初筛抗原，不能区分结核感染与BCG接种，Rv3425相对于BCG来说缺失，且能刺激感染者产生高水平的IFN-γ，可作为结核病细胞免疫诊断的重要靶标。在体液诊断水平上，本研究的结果显示Rv3425特异性抗体仅存在于结核感染的小鼠中(图2B)；结核病人血清特异性抗体IgG与IgM水平明显高于健康人，其作为诊断靶标的灵敏度与特异度都接近于80%，其ROC曲线下面积AUC都较高，分别为0.86与0.79(ACU值越接近1越具有诊断价值)，这说明Rv3425作为靶标抗原用于结核病抗体诊断的方法可作为结核诊断的辅助或初筛手段。巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的主要宿主细胞[13]。许多研究表明，结核分枝杆菌可以调节巨噬细胞激活固有免疫与适应性免疫从而使自身能够在巨噬细胞内长期存在和复制[14,15]。为了进一步探讨Rv3245蛋白对巨噬细胞的作用，将Rv3425真核表达重组质粒pcDNA3.1-Rv3425转染至巨噬细胞RAW264.7后考察其对细胞凋亡的影响。未用纯化的蛋白直接刺激巨噬细胞，是因为在相关类似研究中大部分此类抗原蛋白只有进入胞内才能发挥作用[16,17]。我们的结果显示，Rv3425蛋白在巨噬细胞中能诱导其凋亡，巨噬细胞是结核感染过程中机体发挥免疫功能的重要细胞，这暗示着Rv3425蛋白可能在结核病的致病机制中特别是结核病干酪样坏死、肉芽肿的形成中扮演着重要角色。本研究未能深入探讨其凋亡机制，但这一现象的发现为后续的研究者提供了更多的参考。

综上所述，本研究发现Rv3425蛋白具有较强的抗原性，可作为结核诊断的潜在靶标。此外，Rv3425蛋白能一定程度上引起巨噬细胞的凋亡，可能在结核病的致病机制中扮演着重要角色。

[1] Zumla A,George A,Sharma V,etal.The WHO 2014 global tuberculosis report-further to go[J].Lancet Glob Health,2015,3(1):e10-12.

[2] Behr MA,Wilson MA,Gill WP,etal.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J].Science,1999,284(5419):1520-1523.

[3] Wang L,Yu Y,Chen W,etal.Evaluation of the characteristics of the enzyme-linked immunospot assay for diagnosis of active tuberculosis in China[J].Clin Vaccine Immunol,2015,22(5):510-515.

[4] Ravn P,Munk ME,Andersen AB,etal.Prospective evaluation of a whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis[J].Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(4):491-496.

[5] Okkels LM,Brock I,Follmann F,etal.PPE protein (Rv3873) from DNA segment RD1 of Mycobacterium tuberculosis:strong recognition of both specific T-cell epitopes and epitopes conserved within the PPE family[J].Infect Immun,2003,71(11):6116-6123.

[6] Rosenkrands I,Aagaard C,Weldingh K,etal.Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis[J].Tuberculosis (Edinb),2008,88(4):335-343.

[7] Luo W,Qu ZL,Xie Y,etal.Identification of a novel immunodominant antigen Rv2645 from RD13 with potential as a cell-mediated immunity-based TB diagnostic agent[J].J Infect,2015,71(5):534-543.

[8] Xu Y,Yang E,Wang J,etal.Prime-boost bacillus Calmette-Guerin vaccination with lentivirus-vectored and DNA-based vaccines expressing antigens Ag85B and Rv3425 improves protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis in mice[J].Immunology,2014,143(2):277-286.

[9] Yang E,Gu J,Wang F,etal.Recombinant BCG prime and PPE protein boost provides potent protection against acute Mycobacterium tuberculosis infection in mice[J].Microb Pathog,2016,93(4):1-7.

[10] Arlehamn CS,Sidney J,Henderson R,etal.Dissecting mechanisms of immunodominance to the common tuberculosis antigens ESAT-6,CFP10,Rv2031c (hspX),Rv2654c (TB7.7),and Rv1038c (EsxJ)[J].J Immunol,2012,188(10):5020-5031.

[11] Mori T,Sakatani M,Yamagishi F,etal.Specific detection of tuberculosis infection:an interferon-gamma-based assay using new antigens[J].Am J Respir Crit Care Med,2004,170(1):59-64.

[12] Feng X,Xiu B,Chen K,etal.Enhanced serodiagnostic utility of novel Mycobacterium tuberculosis polyproteins[J].J Infect,2013,66(4):366-375.

[13] Verrall AJ,Netea MG,Alisjahbana B,etal.Early clearance of Mycobacterium tuberculosis:a new frontier in prevention[J].Immunology,2014,141(4):506-513.

[14] Rajaram MV,Brooks MN,Morris JD,etal.Mycobacterium tuberculosis activates human macrophage peroxisome proliferator-activated receptor gamma linking mannose receptor recognition to regulation of immune responses[J].J Immunol,2010,185(2):929-942.

[15] Schreiber T,Ehlers S,Heitmann L,etal.Autocrine IL-10 induces hallmarks of alternative activation in macrophages and suppresses antituberculosis effector mechanisms without compromising T cell immunity[J].J Immunol,2009,183(2):1301-1312.

[16] Chen T,Zhao Q,Li W,etal.Mycobacterium tuberculosis PE_PGRS17 promotes the death of host cell and cytokines secretion via Erk kinase accompanying with enhanced survival of recombinant Mycobacterium smegmatis[J].J Interferon Cytokine Res,2013,33(8):452-458.

[17] Dheenadhayalan V,Delogu G,Brennan MJ.Expression of the PE_PGRS 33 protein in Mycobacterium smegmatis triggers necrosis in macrophages and enhanced mycobacterial survival[J].Microbes Infect,2006,8(1):262-272.

[收稿2016-03-14 修回2016-04-14]

(编辑 许四平)

Research in immunological characteristics of recombinant Rv3425 protein ofmycobacteriumtuberculosis

WANGQian,LUOWei,QUZi-Lu,CHENTie-Long.

DepartmentofPathology,HaiheHospital;KeyResearchLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionforStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300350,China

Objective:To study the immunological characteristics of recombinant Rv3425 protein,to evaluate its diagnosis value and the role in the pathogenicity.Methods: Rv3425 gene was cloned into pET28a vector,the recombinant protein was induced and purified;we analyzed the antigenicity and specificity of Rv3425 by ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay) and Western blot methods,apoptosis effect of Rv3425 to macrophage was deteced by FCM (Flow cytometry method).Results: Purified prokaryotic expressed protein Rv3425 was acquired,we found Rv3425 could elicit high level of IFN-γ in spleen cells and combine with the serum of iH37Rv (inactivatedmycobacteriumtuberculosis) immunized mice;the specific IgG and IgM antibodies of TB (Tuberculosis) patients were significantly higher than healthy donors;Rv3425 also could induce the necrosis of macrophage.Conclusion: Our study found that Rv3425 had strong antigenicity and could induce the apoptosis of macrophage,these findings were very important for the research of TB diagnosis and pathogenicity.

Mycobacteriumtuberculosis;Rv3425;Antigenicity;Macrophage;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.006

王 倩(1984年-)，女，硕士，医师，主要从事结核感染免疫的研究，E-mail:115049520@qq.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0031-05

①本文为2014年湖北省科技厅面上项目(2014CFB392)。

②并列第一作者，天津医科大学总医院检验科，天津300350。

③武汉大学基础医学院，武汉430071。

④通讯作者，武汉大学中南医院感染科，武汉430071，E-mail: tielong.chen@gmail.com。