MicroRNA-155通过调节CXCR4/PI3K/AKT途径影响滋养细胞的侵袭与迁移

张 展 李爱萍 王媛媛 宋婉玉 徐 娜 刘 慧 周 洁

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

MicroRNA-155通过调节CXCR4/PI3K/AKT途径影响滋养细胞的侵袭与迁移

张 展 李爱萍 王媛媛 宋婉玉 徐 娜 刘 慧 周 洁

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

目的：以人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞为研究对象，结合该细胞侵袭和迁移能力的变化情况，研究转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor之后CXCR4的表达变化及其对下游PI3K/AKT信号通路的影响作用，从而探讨miR-155参与子痫前期发生发展的分子机制。方法：设计miR-155 mimics和miR-155 inhibitor，对JEG-3进行转染，通过Transwell侵袭实验、划痕实验，观察转染后细胞的侵袭和迁移能力的变化；利用Real-time PCR检测CXCR4 mRNA的表达；利用Western blot 检测CXCR4及下游p-AKT蛋白的表达水平。结果：Real-time PCR结果显示，miR-155 mimics转染组CXCR4 mRNA相对表达量(0.589±0.096)明显低于空白对照组(1.503±0.090)和阴性对照组(1.146±0.153)，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-155 inhibitor转染组CXCR4 mRNA相对表达量(1.739±0.083)与两组对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示miR-155 mimics转染组CXCR4蛋白和下游p-AKT蛋白表达水平均明显降低，而miR-155 inhibitor转染组CXCR4和p-AKT蛋白水平则升高，与空白对照组和阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示，与空白对照组(63.46±2.37)和阴性对照组(49.29±5.81)侵袭细胞数相比，miR-155 mimics转染组侵袭细胞数(22.89±9.42)明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；同时，miR-155 inhibitor转染组侵袭细胞数(81.50±11.25)明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示，转染miR-155 mimics后，JEG-3细胞相对迁移距离(0.159±0.058)低于空白对照组(1.080±0.045)和阴性对照组(0.823±0.201)，差异有统计学意义(P<0.05)；而miR-155 inhibitor转染组，JEG-3细胞相对迁移距离(1.640±0.078)明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-155可能通过抑制CXCR4的表达进而抑制其下游PI3K/AKT信号通路的活化，从而影响滋养细胞的侵袭及迁移能力，最终导致子痫前期的发生发展。

miR-155；CXCR4；PI3K/AKT；滋养细胞；子痫前期

子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特有的一种疾病，也是导致孕产妇和新生儿发病及死亡的主要原因之一。迄今为止，PE的发病机理尚未清楚。MicroRNA(miRNA)是一组长18～23个核苷酸的单链非编码小RNA分子，近年来越来越多的研究发现子痫前期发生时，一些miRNAs可出现异常表达，miR-155是其中之一[1-3]。miR-155的异常表达可能与滋养细胞侵袭、迁移等功能紊乱的发生密切相关[4]，但具体的分子机制仍然需要更多的探索和研究。CXCR4是G蛋白偶联受体，在整个孕期绒毛组织中均有表达。CXCR4与其配体结合之后，可激活下游PI3K/AKT信号通路，影响细胞内基因的表达，从而调控妊娠早期人绒毛组织中滋养细胞的侵袭和迁移能力[5，6]。在子痫前期中miR-155与CXCR4的相关性及如何调控滋养细胞侵袭和迁移能力的具体机制尚未见相关的研究报道。

在本次研究中，我们以人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞作为研究对象，该细胞系是人类绒毛膜滋养层细胞系的衍生物，其生物学行为和特性与滋养细胞极为相似，很多学者用该细胞系进行体外实验来研究滋养细胞侵袭功能的机制调控。已有很多研究表明JEG-3细胞能特异性表达CXCR4，因此，本实验将此细胞系作为研究滋养细胞功能的细胞模型，分别将miR-155 mimics和miR-155 inhibitor转染进入细胞，通过上调及下调细胞内miR-155的表达水平，检测CXCR4及下游p-AKT蛋白的表达变化，探讨miR-155是否可以通过抑制CXCR4的表达，进而抑制其下游PI3K/AKT信号通路的活化，影响滋养细胞的侵袭和迁移能力，从而探究子痫前期的发病机制，并为临床子痫前期的靶点治疗提供有力的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂

1.1.1 细胞株 人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞株(美国ATCC公司)。

1.1.2 miR-155相关产品合成 miR-155 mimics、Negative Control(NC)、miR-155 inhibitor、miR-155 inhibitor Negative Control(miR-155 inhibitor NC)均由中国上海吉玛公司设计并合成。miR-155 mimics序列(5′ to 3′)为：sense：UUAUGCUAAUCGUGAUA-GGGGU；antisense：CCCUAUCACGAUUAGCAUU-AAUU。miR-155 inhibitor序列(5′ to 3′)为：ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA。NC序列(5′ to 3′)为：sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；antise-nse：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。miR-155 inhi-bitor NC(5′ to 3′)为：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。

1.1.3 主要试剂与仪器 RPMI1640培养基(Hyclone)，Opti-MEM培养基(Gibco)胎牛血清FBS(杭州四季青)，胰酶(Geneview)，转染试剂Lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen)，RNA逆转录试剂盒、SYBR Green荧光染料(Toyobo)，Real-time PCR System，Transwell Chamber(BD Biosciences)，蛋白浓度测定试剂盒(北京康为世纪公司)，蛋白marker分子标记(Geneview)，兔抗人CXCR4单克隆抗体、兔抗人p-AKT单克隆抗体、鼠抗人β-acitn单克隆抗体(Abcam)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 JEG-3细胞接种于培养瓶，用RPMI1640(含10%FBS、100 U/ml 青霉素及100 μg/ml链霉素)完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，每2～3 d进行一次细胞传代(0.25%胰蛋白酶-EDTA消化)。

1.2.2 实验分组与转染 取对数期生长的细胞接种于六孔板，调整细胞密度每孔1×105个细胞，按照冻存批次将JEG-3细胞进行配对分组。细胞汇合度为60%～70%时开始转染，转染过程严格按照说明书进行。实验分为5组，分别为miR-155 mimics组、NC组、miR-155 inhibitor组、miR-155 inhibitor NC组、空白对照组。miR-155 mimics终浓度为50 nmol/L；miR-155 inhibitor 终浓度为100 nmol/L。每组设3个复孔。转染6 h后，更换含血清的完全培养基继续培养24 h。整个培养过程，使用倒置显微镜观察细胞的生长状态。

1.2.3 总RNA提取、反转录及扩增 将转染24 h后的各组细胞，按Trizol法提取细胞总RNA，并测定各组RNA的浓度及纯度。取2 μg RNA反转录成cDNA，反转录体系为20 μl。反转录后进行扩增，每组设置3个复孔。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列：CXCR4-F为ACTACACCGAG-GAAATGGGCT；CXCR4-R为CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA；β-actin-F为GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG；β-actin-R为CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。扩增程序为：95℃，10 min，进行预变性；95℃，15 s；60℃，1 min(共40个循环)，72℃延伸10 min。以目的基因的相对表达量作为判断标准，采用2-ΔΔCt的方法计算CXCR4 mRNA的相对表达量。

1.2.4 Western blot 试验 收集转染48 h后的各组细胞，并用预冷的PBS洗涤3次后加入50 μl蛋白裂解液(含有1∶100的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，得到蛋白质溶液，BCA法测定浓度。蛋白上样量为80 μg，配制12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后转膜，CXCR4采用5% 脱脂奶粉封闭，p-AKT采用5% BSA封闭，室温封闭2 h后弃去封闭液，加入一抗CXCR4(1∶500稀释)、p-AKT(1∶5 000稀释)及内参β-acitn(1∶5 000稀释)抗体，4℃孵育过夜。加入二抗(1∶1 000稀释)于室温下避光孵育2 h，ODYSSEY Clx检测与成像系统进行扫描并拍照。观察5组中蛋白条带颜色的深浅程度并比较。

1.2.5 Transwell 细胞侵袭试验 在接种细胞之前，需要对Transwell小室和24孔板进行平衡：分别在上室加100 μl无血清培养基，下室加600 μl FBS，置于37℃，5%CO2环境下过夜。收集转染后经过24 h饥饿处理的各组细胞，计数后按2×104个细胞/孔接种于上室，在37℃，5%环境下培养36 h，随后将上室细胞擦除，将小室膜下室侧的细胞甲醇固定，吉姆萨染色后进行拍照，高倍镜下取5个视野进行计数，取其平均值，每组重复3次。

1.2.6 划痕实验 转染后24 h对细胞进行划痕实验。将六孔板内培养基换成无血清培养基使细胞饥饿12 h后，用200 μl移液器吸头沿培养板呈“一”字形划痕，形成中央空白区，PBS洗涤1次，并在显微镜下拍照记录划痕区域(0 h)。继续培养24 h，观察并拍照(24 h)。使用Image J软件分析细胞的相对迁移距离，实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对CXCR4 mRNA表达的影响 Real-time PCR实验表明：与 NC组及空白对照组相比，miR-155 mimics转染组CXCR4 mRNA 在JEG-3细胞中的表达明显降低(见图1、表1)；与miR-155 inhibitor NC组及空白对照组相比，miR-155 inhibitor转染组CXCR4 mRNA 在JEG-3细胞中的表达明显升高(见图2、表2)。

2.2 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对CXCR4 及p-AKT蛋白表达的影响 Western blot实验结果表明：与NC组及空白对照组相比，miR-155 mimics转染组CXCR4 及p-AKT蛋白在JEG-3细胞中的表达均明显降低(见图3)；与miR-155 inhibitor NC组及空白对照组相比，miR-155 inhibitor转染组CXCR4 及p-AKT蛋白在JEG-3细胞中的表达均明显升高(见图4)。

图1 转染miR-155 mimics 对JEG-3细胞中CXCR4 mRNA表达的影响Fig.1 Effect on expression of CXCR4 mRNA of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimicsNote: Compared with blank control group,**.P<0.01;compared with NC group,*.P<0.05.

GroupsnCXCR4mRNABlankcontrolgroup121503±0090NCgroup121146±0153miR⁃155mimicsgroup120589±00961)2)F3659P0035

Note：Compared with blank control group,1)P<0.01;compared with NC group,2)P<0.05.

图2 转染miR-155 inhibitor 对JEG-3细胞中CXCR4 mRNA表达的影响Fig.2 Effect on expression of CXCR4 mRNA of JEG-3 cells after transfection of miR-155 inhibitorNote: Compared with blank control group,*.P<0.05;compared with inhibitor NC group,**.P<0.01.

2.3 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对滋养细胞侵袭能力的影响 Transwell 细胞侵袭实验表明：与 NC组及空白对照组相比，miR-155 mimics组穿膜细胞数明显减少，侵袭力降低(见表3、图5)；与miR-155 inhibitor NC组及空白对照组相比，miR-155 inhibitor组穿膜细胞明显增加，侵袭力增加(见表4、图5)。

GroupsnCXCR4mRNABlankcontrolgroup121498±0090InhibitorNCgroup120880±0245miR⁃155inhibitorgroup121739±00831)2)F2834P0027

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with inhibitor NC group,2)P<0.01.

图3 转染miR-155 mimics对JEG-3细胞内CXCR4及p-AKT蛋白表达的影响Fig.3 Effect on expression of CXCR4 and p-AKT protein of JEG-3 cellls after transfection of miR-155 mimicsNote: 1.Blank control group;2.NC group;3.miR-155 mimics group.

图4 转染miR-155 inhibitor对JEG-3细胞内CXCR4及p-AKT蛋白表达的影响Fig.4 Effect on expression of CXCR4 and p-AKT protein of JEG-3 cells after transfection of miR-155 inhibitorNote: 1.Blank control group;2.miR-155 inhibitor NC group;3.miR-155 inhibitor group.

2.4 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对滋养细胞迁移能力的影响 划痕实验表明：24 h之后，与 NC组及空白对照组相比，miR-155 mimics组JEG-3细胞的迁移能力明显减弱(见图6、表5)；与miR-155 inhibitor NC组及空白对照组相比，miR-155 inhibitor组细胞的迁移能力明显增强(见图6、表6)。

GroupsnThenumberofinvasioncellsBlankcontrolgroup86346±237NCgroup84929±581miR⁃155mimicsgroup82289±9421)F12737P0000

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

GroupsnThenumberofinvasioncellsBlankcontrolgroup86346±237InhibitorNCgroup84890±559miR⁃155inhibitorgroup88150±11251)F294P0027

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

GroupsnRelativemigrationdistanceBlankcontrolgroup51080±0045NCgroup50823±0201miR⁃155mimicsgroup50159±00581)F29600P0017

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

图5 转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对JEG-3细胞侵袭能力的影响(×400)Fig.5 Effect on ability of invasion of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor(×400)

图6 转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor对JEG-3细胞迁移能力的影响(×200)Fig.6 Effect on ability of migration of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor(×200)

GroupsnRelativemigrationdistanceBlankcontrolgroup51079±0045InhibitorNCgroup50724±0267miR⁃155inhibitorgroup51640±00781)F16103P0024

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

3 讨论

子痫前期是正常血压妇女在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿等临床表现的一种特发性高血压综合征，可引起严重的母胎并发症，也是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一[7]。目前，欧美国家子痫前期发病率较低，大约为2%～5%，而发展中国家子痫前期却更常见，发病率约为10%，亚洲和非洲子痫前期占孕产妇死亡率的9%[8]。每年全世界1 000万个孕产妇中由于妊娠期高血压，特别是子痫前期，造成76 000例孕产妇死亡和500 000个胎儿或新生儿的死亡[9]。美国心脏病学会也曾将子痫前期纳入心血管疾病发生的危险因素中，并建议了解有子痫前期病史的患者并改善其生活方式[10,11]。但PE的发病机制至今仍不清楚，而且临床上尚缺乏有效的治疗手段，很多情况下不得不提前终止妊娠，造成妊娠失败，许多流行病学研究也证明妊娠期子痫前期的发生可能对后代产生长远的不良后果[12,13]。PE的发病机制可涉及胎盘缺血缺氧、炎症反应、与PE相关的信号通路的改变、滋养细胞浸润异常、母胎界面免疫异常、胎盘的局部凝血和抗凝血机制失衡以及miRNA的表达谱异常等多种因素[14,15]。

自1993年，Lee等[16]在秀丽隐杆线虫中发现第一个miRNA至今，已有超过2 000个miRNAs被发现，且经生物信息学预测miRNA可能调节人类基因组中60%的编码蛋白质的基因[17]。miRNA在炎症和肿瘤方面的研究已取得了长足的进展，而与子痫相关的miRNA的研究才刚刚开始。miRNA可通过与mRNA的3′端非编码区(3′-untranslated region，3′UTR)进行完全或不完全互补配对，起转录后调节基因表达的作用，在细胞的的分化发育、增殖、侵袭、凋亡等生物学过程中发挥重要作用[18]。miR-155基因，由BIC基因编码，位于人类21q21.3号染色体，是一种与炎症、肿瘤和免疫调节[19]密切相关的miRNA。目前很多研究都有发现miR-155在PE胎盘中有显著的差异性表达，尤其在重度PE胎盘中，miR-155呈高表达。还有研究显示，在胃癌、乳腺癌等[20，21]疾病中，miR-155可靶向调控CXCR4的表达，影响癌细胞的增殖和血管生成，增加肿瘤细胞的侵袭性。因此，miR-155可能是通过抑制滋养细胞中CXCR4的表达，抑制下游AKT蛋白的磷酸化，影响PI3K/AKT途径的活化，使滋养细胞的侵袭与迁移能力下降。

CXCR4，又称趋化因子受体4，位于人类2q21号染色体，由352个氨基酸组成。可表达于多种细胞的细胞膜上，包括滋养细胞，且在整个孕期绒毛组织中均有表达[22]。本研究的RT-PCR和Western blot结果也证明在分别转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor之后，人绒毛膜滋养细胞系JEG-3细胞株中CXCR4在mRNA和蛋白水平均发生了显著的变化。其中，转染miR-155 mimics之后，JEG-3细胞中CXCR4 mRNA和蛋白的相对表达水平均明显下降；反之，转染miR-155 inhibitor后，CXCR4 mRNA和蛋白的相对表达水平均明显升高。因此，推测在子痫前期发生过程中，miR-155可能通过抑制CXCR4的表达影响滋养细胞的功能。

同时，本研究还通过Transwell和划痕实验检测转染后JEG-3细胞的侵袭和迁移能力的变化。结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，转染miR-155 mimics组JEG-3细胞侵袭及迁移能力均下降，而转染miR-155 inhibitor组JEG-3细胞侵袭及迁移能力则明显升高。因此，从细胞水平证明miR-155可能通过CXCR4调控滋养细胞的侵袭与迁移能力。

本研究还检测了在转染JEG-3细胞后，CXCR4下游关键因子AKT的磷酸化水平，证明miR-155是否可通过抑制CXCR4影响下游PI3K/AKT途径的活化。Western blot结果显示p-AKT蛋白的表达水平在转染miR-155 mimics之后发生显著下降，而在转染miR-155 inhibitor之后则明显升高。在研究乳腺癌时，Liang等通过转染miR-155抑制CXCR4的表达，发现转染组MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭与迁移能力均下降，并进一步通过检测AKT蛋白的磷酸化水平发现miR-155可能是通过CXCR4/SDF-1/AKT途径发挥其抑制作用。结合Liang等[23]的研究，本次研究认为miR-155可能通过下调CXCR4的表达降低下游AKT蛋白的磷酸化水平，从而抑制滋养细胞的侵袭、迁移等生物学功能，在临床治疗子痫前期时也可作为一个潜在的治疗靶点。

综上所述，本研究从细胞水平阐明miR-155参与子痫前期发病机制的一个可能的分子机制，即miR-155可能通过抑制CXCR4/PI3K/AKT信号通路影响滋养细胞的侵袭、迁移等生物学功能，进而促进子痫前期发生、发展，也为临床子痫前期的治疗提供了一个可行的研究思路。

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[收稿2016-07-09 修回2016-09-07]

(编辑 张晓舟)

MicroRNA-155 induced invasion and migration of human trophoblast cells via CXCR4/PI3K/AKT signaling pathway

ZHANGZhan,LIAi-Ping,WANGYuan-Yuan,SONGWan-Yu,XUNa,LIUHui,ZHOUJie.

TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

Objective:To investigate the effect on the CXCR4/PI3K/AKT pathway after the transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor combined with the research on the ability of invasion and migration of human chorionic JEG-3 trophoblast cells.Methods: Chemically synthesized miR-155 mimics and miR-155 inhibitor were transfected into JEG-3 cells.The effect on the ability of invasion and migration were analyzed by Transwell migration assay and Wound healing assay.The expression of CXCR4 mRNA was detected by Real-time PCR.The expression of CXCR4 and p-AKT protein were detected by Western blot.Results: Transfection with miR-155 mimics significantly down-regulated the expression of CXCR4 as compared with the control group(P<0.05);JEG-3 cells transfected miR-155 mimics had lower levels of migration and invasion capacity than cells in the control group(P<0.05).However,transfection with miR-155 inhibitor significantly up-regulated the expression of CXCR4 as compared with the control group(P<0.05);JEG-3 cells transfected miR-155 inhibitor had higher levels of migration and invasion capacity than cells in the control group(P<0.05).Addition,the expression of p-AKT protein of JEG-3 cells was down-regulated after transfected miR-155 mimics,and the expression of p-AKT protein of JEG-3 cells was up-regulated after transfected miR-155 inhibitor.Conclusion: miR-155 may inhibits the invasion and migration of trophoblast cells by regulating CXCR4/PI3K/AKT pathway contributing to the development of preeclampsia.

miR-155;CXCR4;PI3K/AKT;Trophoblast cells;Preeclampsia

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.008

张 展(1959年- )，女，博士，教授，主要从事生殖免疫学方面研究，同时供职于商丘医学高等专科学校，E-mail:zhangzhanzdsfy@126.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)01-0041-07