虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾的生长、繁殖及免疫力的影响

安振华，王柳富，李晴

（扬州大学动物与科学技术学院，江苏扬州 225009）

虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾的生长、繁殖及免疫力的影响

安振华，王柳富，李晴

（扬州大学动物与科学技术学院，江苏扬州 225009）

本文目的旨在研究虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下（25μg/L）克氏原螯虾的免疫力及生长繁殖的影响。实验设计四个梯度的饲料中虾青素添加比例分别为（0、5、10、20mg/g）养殖周期持续8星期。结果表明虾青素显著提高了克氏原螯虾肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和碱性磷酸（AKP）的活力（P＜0.05）。5 g/kg虾青素的添加量即可对SOD酶活具有明显提升（P＜0.05）；10 g/kg的虾青素添加量对AKP的提升最为明显（P＜0.05）；研究还发现虾青素可显著提高微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾的存活率和特定生长率（SGR）（P＜0.05），提高克氏原螯虾雌虾的抱卵量。研究表明虾青素作为一种抗氧化剂适宜于在克氏原螯虾饲料中添加，并且具有提高虾体免疫活力，缓解微囊藻毒素MC-LR对虾体氧化胁迫的作用。

MC-LR；克氏原螯虾；免疫指标；虾青素

作为世界上散布最广泛、最具侵略性的螯虾[1]，克氏原螯虾对极端环境有很强的耐受性，并且在水华经常爆发的一些水域也很容易存活[2]。有研究表明克氏原螯虾可以以微小藻类为食，且会在它们的器官内蓄积藻毒素[3]。实地调查常发现，在含微囊藻毒素较多的水体中，克氏原螯虾摄食虽然正常，但往往出现生长缓慢的问题。

微囊藻毒素被认为具有破坏生物体内氧化还原平衡的能力,除了抑制磷酸酶致毒外，氧化应激以及线粒体通透性转换在MC致毒机制中也起着很重要的作用。MC可以诱导细胞内活性氧（ROS）产生，导致细胞损伤和脂质过氧化，并有可能通过某些通路诱导细胞凋亡。有研究表明微囊藻毒素在鱼类和其他一些水生生物的器官或组织内随着时间的增加，其含量会逐渐降低[4]。一些研究的结果显示MC-LR在水生生物体内的蓄积和引起的脂质过氧化反应主要发生在肝脏中[5]，卵巢次之[6]，也许这就是生长于水华爆发的水体中的克氏原螯虾繁殖力低的原因。

虾青素（Astaxanthin），又名变胞藻黄素或虾红素，有着色、促进生长和增强免疫力的生物功能，并且是目前为止发现的抗氧化能力最强的物质之一，能够有效清除细胞内的氧自由基的作用[7]。本项目期冀于研究在微囊藻毒素MC-LR胁迫下，通过饲料中添加虾青素对克氏原螯虾生长发育的影响，以探讨虾青素缓解微囊藻毒素MC-LR对克氏原螯虾胁迫的机制，为克氏原螯虾的高效、安全生产提供一定的技术支持和基础理论依据。

1 材料及方法

1.1 试验材料来源

本次实验使用的克氏原螯虾购自江苏省扬州市市场，原产于扬州宝应市，选附肢齐全、健康活泼、规格一致的个体作为实验虾，并将其置于（15± 3）℃和自然光照环境中暂养一个月。饲料是由江苏富裕达粮食制品有限公司生产的虾用饲料，饲料成分表见表1。MC-LR购自北京伊普瑞斯科技有限公司，溶于纯净水后保存在冰箱内，在使用时直接按比例添加到玻璃箱中。虾青素购自福建日冕科技股份有限公司，为单粒500 mg规格胶囊状保存（能值34.5 kJ/g），每粒含虾青素60 mg，胶囊内辅料为大豆油。使用时将胶囊刺破后与饲料混合拌匀。实验投喂的各组饲料中因虾青素添加量不同造成的能值差异，通过额外补充等能值的大豆油来平衡。

表1 饲料的能值及生化组成

1.2 实验方法

本实验设计四个虾青素添加梯度，饲料中虾青素添加梯度分别为0、5、10、20 mg/g，每个处理设3个重复，实验共用虾96只（20.6±7.5）g。每个重复设置为8只规格一致的克氏原螯虾成虾（4雌4雄，组间体质量无统计学意义差异），在温室的玻璃水族箱中饲养（800 mm×600 mm×400 mm），微囊藻毒素的胁迫浓度25μg/L。同时设置一组水体中无MC-LR添加的空白组，空白组所投喂的饲料中无虾青素添加。MC-LR购自北京伊普瑞斯科技有限公司，相关浓度测定使用北京金强环保公司ELISA试剂盒测定。

1.3 日常饲养管理

实验前测定配制饲料的生化成分和能值。实验中每天在8：00与18：00分两次投喂已配置好的饵料。饲养水温用加热棒控制在（15±3）℃。每天换水量保持在水族箱容积的1/3，溶氧量保持在4.0mg/ L以上。换水时调节好不同水族箱中的MC-LR毒素的浓度，使其浓度保持恒定在25μg/L。每天记录测定摄食和抱卵情况。若有死虾则及时拣出，实验结束时测量虾体体长、体质量和怀卵量。

白鹫的速度比滑翔翼快着许多，冲在最前方的白鹫已然到达了战场。它发出一声狠厉的嘶鸣，身子向下俯冲，伸出钢钩一般的利爪，勾住了一条土狼的脊骨。它双翅一振，带着土狼冲天而起，飞到半空时，又松开利爪将土狼丢下。土狼惊恐地嚎叫着，重重摔在岩石上，叫声戛然而止，它的身子也变成了软趴趴的一坨烂肉。

1.4 实验指标的测定

1.4.1免疫指标的测定每个水族箱中随机抽样取出4个样本，取出每个样本的肝胰腺，将不同重复组的肝胰腺分别放入研磨器中加入6mL的蒸馏水，按水族箱的编号对每个研磨器进行编号。将先研磨好的待测样品插在冰盒里保存。取研磨好的样品1.8 mL在型号为Centrifuge 5415R的离心机内离心后取上清液进行后续操作。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP）采用微量酶标法，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase SOD）采用的是WST-1法，所用的酶活测试试剂盒均来自南京建成生物工程研究所，蛋白浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，测定酶标仪型号为IMarkTM168-1130。

AKP=（测定OD值－空白OD值/标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（0.02mg/mL）÷待测样品蛋白浓度（gprot/mL）

SOD抑制率=（（A对照－A对照空白）－（A测定－A测定空白））/（A对照－A对照空白）×100%

SOD活力=SOD抑制率÷50%×反应体系稀释倍数0.24 mL/0.02 mL÷待测样本蛋白浓度（gprot/ mL）。

1.4.2生长繁殖的测定①繁殖力：实验结束时计算克氏原螯虾的抱卵量。②特定生长率（Special growth rate SGR）SGR=（lnY2-lnY1）/t×100%，式中Y1、Y2分别表示实验开始和结束时克氏原螯虾的体质量。③存活率：存活率=终末存活尾数/初始存活尾数×100%。

2 结果与分析

由图1可见，添加虾青素可显著提高胁迫组克氏原螯虾肝脏中SOD的活力，其中5 g/kg虾青素的添加量对SOD的提升最为显著。10 g/kg以下的虾青素添加量使得胁迫组的SOD活力远大于未胁迫组并且SOD的活力随着虾青素的增加而增强。20 g/kg虾青素的添加量时SOD活力明显下降。

由图2可见，10 g/kg以上虾青素的添加量对胁迫组AKP活力提升最为明显，且远超未胁迫组AKP的活力，总体而言，添加虾青素的胁迫组AKP活力均大于未胁迫组。

2.2 虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾生长繁殖的影响

由表2可见，胁迫下克氏原螯虾的繁殖力低于未胁迫组，但随着虾青素的添加，胁迫组的平均抱卵量和相对抱卵量都呈持续上升的态势。

图1 虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾体内SOD的影响

图2 虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾体内AKP的影响

2.3 虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾特定生长率、成活率和饵料系数的影响

由表3可见虾青素的添加对胁迫组的特定生长率、成活率影响显著，添加量在10 g/kg时对SGR最大，且10 g/kg以上时，胁迫组的SGR大于未胁迫组。同时，虾青素的添加显著提高了胁迫组的成活率，由表3可看出20 g/kg的添加量时，胁迫组的成活率达到最大，但均未超过未胁迫组，且对饵料系数的影响不明显。

3 讨论

3.1 虾青素对克氏原螯虾生长发育的影响

在促进生长方面，吕玉华[8]等的研究表明，虾青素能使罗氏沼虾的质量增长率显著提高14.48%，Petit[9]等发现，在饲料中添加虾青素可缩短日本囊对虾的蜕皮周期，促进生长。此外Medina[10]报道，当凡纳滨对虾仔虾在低盐度海水中生活时，投喂80 mg/ kg的虾青素降低了虾的呼吸代谢水平。这说明，虾青素能使低盐度胁迫的凡纳滨对虾降低了能量消耗，促进对虾的生长。本实验中虾青素的添加不仅提高了克氏原螯虾的特定生长率，同时提高了其存活率和繁殖力，这说明虾青素不仅可以缓解微囊藻毒素MC-LR造成的机体氧化应激，同时可以缓解其在克氏原螯虾体中的积累，尤其是在其蓄积的主要的靶器官-卵巢[6]中的积累。考虑到微囊藻毒素MC-LR的广泛存在，通过在饲料中添加一定量的虾青素，可能对提高养殖池塘中克氏原螯虾的出苗量有一定帮助。

表2 虾青素对微囊藻毒素MC-LR胁迫下克氏原螯虾繁殖力的影响

3.2 虾青素对克氏原螯虾免疫力的影响

现有研究证实生物体内的抗氧化酶系统[如谷胱甘肽S转移酶（GPS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）]活性的降低，将会削弱机体的抗氧化防御能力[11]，从而影响生物正常的生长和呼吸功能，降低生长速度和免疫力[12]。而抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸、硒等）可通过减少ROS生成和降低丙二醛（MDA）水平、保护抗氧化酶的活性，减轻细胞骨架破坏，从而有效预防和对抗微囊藻毒素引起的氧化应激反应，而虾青素也正是这样一种具有提高机体抗氧化系统活力，减轻氧化应激的物质，虾青素同样具有增强生物体对外界环境应激抵抗力的能力。

谢剑华[13]等在日本沼虾研究中发现：虾青素可提高日本沼虾的免疫力。温为康[14]等通过对饲料中添加虾青素，发现虾青素能显著提高斑节对虾的酚氧化酶活力，其活力随虾青素的添加量缓慢上升，160mg/kg是略有下降，虾青素激活了酚氧化酶原系统。本实验研究发现虾青素的添加除了可以提高酚氧化酶活力外，也相应的提高了AKP和SOD的活力。这说明饲料中虾青素的添加激活并提高了克氏原螯虾体细胞内的整体抗氧化能力，提高了克氏原螯虾机体免疫力。

Chien等[15]通过对墨吉对虾幼体饲喂含虾青素（80mg/kg）的饲料，然后将这些对虾置入急剧变化的环境中（盐度从32降到0或温度从27℃降到5℃）持续5min，再分别测定实验组（80mg/kg组）和对照组（0添加组）虾体的平均恢复率。结果表明实验组恢复率为对照组的1.17倍。另外还发现实验中热应激对虾恢复率的影响远大于渗透压的影响，表明虾青素可以增强墨吉对虾对外界应激的抵抗能力。在本实验中同样发现一定量的虾青素添加可以帮助克氏原螯虾抵抗微囊藻毒素MC-LR带来的氧化应激，由此可见提高水生生物体内的抗氧化酶系统活力对微囊藻毒素MC-LR引起的氧化胁迫具有一定的缓解作用，这为通过添加虾青素缓解微囊藻毒素MC-LR对克氏原螯虾造成的氧化胁迫提供了重要的理论依据。

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The effects of astaxanthin on imm unity，reproduction of Procambarus clarkii under M icrocystin-LR stress

An Zhenhua，Wang Liufu，LiQing
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

This research aimed to study the effects of astaxanthin on immunity，reproduction of Procambarus clarkii undermicrocystin-LR（MC-LR）stress.The Procambarus clarkii were cultured under MC-LR stress（25 ug/L）and were fed with fodders containing astaxanthin（0，5，10，20 g/kg）for 8 weeks in glass tanks（800mm× 600 mm×400 mm）.The results showed that astaxanthin can significantly improve the activity of superoxide dismutase（SOD）and alkaline phosphatase（AKP）in liver of Procambarus clarkii（P＜0.05）.Astaxanthin can significantly improve the survival rate and specific growth rate（SGR）of Procambarus clarkii under MC-LR stress（P＜0.05）.The 10 g/kg contentof astaxanthin in fodder can be a practical and economic choice.

MC-LR；Procambarus clarkii；immune index；astaxanthin

Q175

：A

：1004-2091（2017）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.007

2016-04-24）

江苏省水产三新工程（Y2015-28）

安振华（1981-），男，讲师，研究方向为水产动物生理.E-mail:anzhenhua@yzu.edu.cn