根据萌发率和出苗率筛选高粱种子萌发期耐低温材料

张丽霞+张灵敏+霍岩

摘要：将从全球收集的631份高粱材料进行8 ℃低温胁迫处理14 d，再统计种子相对萌发率和相对出苗率；再将相对萌发率和相对出苗率都达到一级的49份材料进行6 ℃低温处理，相对萌发率和相对出苗率都达到一级的材料有6份，随后进行4 ℃低温处理。结果显示，8 ℃低温处理对相对出苗率影响较小，但加重了后续筛选工作压力；4 ℃低温处理对相对萌发率影响较大，大部分材料都不能萌发，筛选条件苛刻且容易遗漏部分优良材料。因此，综合考虑萌发率和出苗率时，初步筛选高粱种子萌发期耐低温材料时选择6 ℃低温处理14 d较为适宜。

关键词：高粱；种子萌发；低温胁迫；相对萌发率；相对出苗率；耐低温；种质资源

中图分类号：S514.02 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0080-04

高粱是喜温作物，生长发育的不同时期都容易遭受低温的影响，给高粱生产带来较大损失[1-2]。國内外关于高粱低温方面的研究报道较少且不够深入，国内的研究主要是关于高粱萌发期、芽期和苗期耐低温材料的筛选和鉴定[3-8]，国外的研究更多的是关于高粱耐低温QTLs的挖掘[9-11]。高粱在播种的早春阶段经常遭遇低温，影响种子萌发导致出苗率低或在土壤中“粉种”、霉烂，这是造成高粱减产的重要因素之一[12-13]。前人的研究结果表明，高粱萌发的下限温度在各品种间有很大差异，基本在4～8 ℃之间[3-4，14]。关于高粱萌发阶段耐低温材料筛选、鉴定的方法主要包括种子低温胁迫下的萌发率以及种子低温处理后统计出苗率。龚文娟等利用人工气候箱对从黑龙江省省内收集的407份高粱进行种子萌发阶段的筛选试验，将供试材料分别在<5、5、6、7、8、9、10、>10 ℃ 处理14 d后统计种子的萌发率[3]。陈香兰等对黑龙江省471份高粱材料进行种子萌发阶段的低温处理，将供试材料低温冷水浸种24 h后置于4 ℃人工气候箱中处理7 d，然后于25～30 ℃下处理3～5 d，统计萌发率[5-6]。马世均等选取国内外不同生态类型的高粱材料115份，分别置于8、6、4 ℃条件下处理，19 d后统计萌发率[4]。张桂香等将来自美国、印度和中国等不同地区的168份高粱材料种于小盆内，置于1～2 ℃的智能培养箱中处理 5～8 d，然后调试温度至 12～15 ℃，根据出苗率筛选种子萌发阶段耐低温材料[7，15]。虽然低温条件下种子的萌发率是衡量耐低温的重要指标，但是最终的出苗率才是人们更关注的结果。因此，衡量萌发阶段的耐低温特性应综合考虑种子的萌发率和出苗率。因此，本研究利用人工气候箱对从中国及其他世界各地收集的631份高粱材料进行种子萌发阶段耐低温筛选、鉴定，综合考虑相对萌发率和相对出苗率从中筛选出优良的耐低温材料，且提出适宜的高粱种子萌发期耐低温材料筛选条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验收集了中国以及世界其他不同地区（非洲、亚洲、美洲和北美洲等）、不同类型（甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和国内农家种）的高粱材料631份，其中包括国际热带半干旱地区作物研究所（ICRISAT）提供的微核心种质243份，中国国家作物种质库中期库提供国内农家种251份，辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心提供甜高粱、草用高粱和国内常规品种等136份和通辽市农业科学研究院提供选育品种1份。

1.2 试验方法

利用国产MGC-350HP-2型人工气候箱（上海一恒科学仪器有限公司），对收集到的631份高粱材料进行8 ℃低温胁迫处理，14 d后统计种子的相对萌发率，随后置于25 ℃下统计相对出苗率。萌发以种子露白为标准，出苗以2张子叶完全展开为准。

具体操作步骤为：选取籽粒饱满、均匀一致且无病虫害的风干种子100粒，放在垫有毛巾的发芽盒中，加入一定量的无菌水，使毛巾保持湿润的状态。将发芽盒置于人工气候箱进行8 ℃低温胁迫处理，14 d后统计种子的相对萌发率，随后置于25 ℃人工气候室的培养架上，5 d后统计相对出苗率。对照材料置于25 ℃培养架上3 d后统计种子的萌发率，萌发 5 d 后统计种子的出苗率。相对萌发率=（处理后种子的实际萌发率/对照种子萌发率）×100%；相对出苗率=（处理后种子的实际出苗率/对照种子出苗率）×100%。试验重复 2～3次，求平均值进行统计，统计标准见表1。耐低温级别达到一级的材料继续进行6、4 ℃的低温筛选，14 d后统计相对萌发率，随后统计相对出苗率。

2 结果与分析

2.1 相对萌发率和相对出苗率

2.1.1 相对萌发率 供试631份材料中相对萌发率达到一、二、三、四、五、六级的样品数分别为91、120、102、88、78、152份，占总样品比例分别为14.42%、19.02%、16.16%、13.95%、12.36%、24.09%，相对萌发率几乎较均匀地分布在不同的等级中（表2）。

2.1.2 相对出苗率 供试631份材料中相对出苗率达到一、二、三、四、五、六级的样品数分别为308、157、72、45、34、15份，所占总样品比例分别为48.81%、24.88%、11.41%、7.13%、5.39%、2.38%，相对出苗率达到一级和二级的为465份，占总材料的73.69%。

综上所述，8 ℃低温处理对种子的相对萌发率有较大的影响，这也表明低温胁迫下材料之间的差异显著。但是，8 ℃低温胁迫14 d后，大部分材料的相对出苗率较高，8 ℃低温处理对种子的相对出苗率影响较小。为了进一步说明相对萌发率和相对出苗率的关系，利用DPS数据处理系统分析了8 ℃低温胁迫处理14 d后相对萌发率和相对出苗率的相关性，结果表明两者之间并没有相关性，即低温胁迫条件下，种子相对萌发率高的材料相对出苗率不一定高，种子不萌发或相对萌发率低的材料相对出苗率不一定低。

2.2 8 ℃低温处理下相对萌发率和相对出苗率维恩比较分析

在8 ℃低温条件下，种子萌发率和出苗率之间的变化关系复杂，同样存在萌发率高、出苗率也高的材料。如表2所示，根据相对萌发率和相对出苗率统计标准，已经将631份材料分别划分到6个不同的等级中，利用维恩图的形式将每个等级相对萌发率和相对出苗率的材料进行归类分析，一、二、三、四、五、六级相对萌发率和相对出苗率共有的材料分别是49、39、20、7、2、5份，总计122份（图1）。8 ℃处理后，相对萌发率较均匀地分布在6个等级中，而8 ℃低温对最终的相对出苗率影响较小，相对出苗率主要集中在前3个等级中，占总材料的85.1%（表2）， 前3个等级中相对萌发率和相对出苗率共有材料108份，占总共有材料的88.52%。

低温条件下，种子的相对萌发率和相对出苗率相关性较差，以相对萌发率和相对出苗率都达到一级的材料为例（图2）， 相对萌发率达到一级的材料共91份，但相对出苗率差异却很大，其中相对出苗率达到一级49份、二级23份、三级10份、四级5份、五级4份，分别占相对萌发率达到一级材料的53.85%、25.27%、10.99%、5.49%、4.40%，分析结果表明，91份一级材料相对萌发率和相对出苗率之间没有相关性（图2-A）。相对出苗率达到一级的材料共308份，相对萌发率差异更大，其中相对萌发率达到一级49份、二级44份、三级32份、四级44份、五级34份、六级105份，分别占相对出苗率达到一级材料的15.92%、14.29%、10.39%、14.29%、11.04%、34.09%（图2-B）。308份一级材料相对萌发率和相对出苗率进行相关性分析，相关系数r为-0.192 5、P值为0.000 7（相关系数临界值α=0.05时，r=0.111 8；α=0.01 时，r=0.146 6），达到极显著负相关，表明即使低温处理后相对萌发率较低或者根本暂不萌发的材料待温度适宜时都有较高的相对出苗率。

2.3 6、4 ℃低温处理下相对萌发率和相对出苗率比较分析

筛选较优良的耐低温材料应综合考虑萌发率和出苗率，

因此重点关注相对萌发率和相对出苗率都达到一级的49份材料（图1和图2）。将这49份材料进行6 ℃低温处理，14 d后统计相对萌发率和相对出苗率，相对萌发率达到一级16份、二级6份、三级6份、四级6份、五级1份、六级14份，相对出苗率达到一级14份、二级24份、三级7份、四级3份、五级1份（表3），其中两者共有的材料分别为一级6份、二级2份、其他级别为0（图3）。将6 ℃低温处理下相对萌发率和相对出苗率都达到一级的材料置于4 ℃低温处理，14 d后统计相对萌发率和相对出苗率，只有来自中国的1份农家种材料萌发，相对萌发率仅为4.13%。即使种子在4 ℃低温条件下没有萌发，但2份来自南非的材料相对出苗率也达到75%以上，另外4份材料的相对出苗率在40%～50%之间，其中3份材料来自中国，1份材料来自美国（表4）。

3 讨论

高粱是世界第五大重要的粮食作物，具有高产、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱、耐高温、耐寒冷和抗涝等特点[16]，深入挖掘高粱抗逆基因对探究高粱高抗逆性的分子机制及大田实践生产应用都具有非常重要的意义。目前，已经在高粱中应用全基因组关联分析方法（genome-wide association studies，GWAS）定位不同農艺性状基因[17]。水稻[18]、玉米[19]、小麦[20]和番茄[21]等作物对耐低温资源的挖掘利用、耐冷相关基因的定位以及耐低温种质在生产和育种上的应用都有较深入的研究。陈亮等通过珍汕97B与多年生水稻种质AAV002863构建的DH群体，QTL定位分析检测到2个与低温发芽力相关的基因座[22]。本研究详细统计了631份高粱材料的相对萌发率和相对出苗率且笔者所在的实验室已获得这些群体材料的简化基因组测序结果，利用全基因组关联分析方法可以检测到与低温萌发力和出苗相关的SNP，为定位和克隆高粱种子萌发期耐低温基因奠定基础。

低温条件下，如何真实统计种子的萌发率和出苗率叙述不一[3，15]，一种方法直接以实际萌发（出苗）种子数/萌发种子总数，这种方法简单、工作量少，尤其能针对大批材料进行初步筛选，大部分材料在正常条件下萌发率都比较高，达到95%以上，低温胁迫后即使采用这种方法统计萌发率、出苗率与实际出入较小；另一种方法是处理后种子实际萌发（出苗）率/对照种子萌发（出苗）率，有部分材料即使是当年的新种，在正常的条件下萌发率较低，有的只有80%左右，在低温胁迫后采用这种方法统计能够比较客观地反映出低温对种子萌发的影响。但是，筛选耐低温优良的种质材料时，正常条件下萌发率较低的材料应舍弃，否则在大田生产中会加大种子的使用量和成本。

筛选种子萌发期耐低温材料时，研究人员通常以种子的萌发势、萌发率或者最终的出苗率为指标去筛选耐低温材料[3，7，15]。以种子萌发势和萌发率为指标筛选耐低温材料时，有时会遗漏较优良的材料。经过以上的研究发现，低温处理后，萌发率较低或根本不萌发的种子在温度适宜时又重新萌发、出苗。实验室内利用发芽盒进行种子萌发时，即使种子长菌也很少发生烂种的情况，低温（8、6、4 ℃）处理14 d后，温度越低对相对萌发率的影响越大，4 ℃时大部分种子难以萌发，但都有较高的相对出苗率。这种情况和大田实际有所不同，大田播种后遭遇低温低湿后极易产生烂种的危险，出苗率往往很低。实验室内模拟低温处理，仅以种子的出苗率为标准筛选耐低温种子也存在一定的风险性，实验室内种子萌发率低或未萌发的种子虽然出苗率很高，但在大田中容易出现烂种现象。大田中大规模筛选耐低温材料受气候的影响和限制，很难重复、稳定进行。因此，建议实验室内筛选耐低温材料时，应综合考虑萌发率和出苗率。

实验室内模拟低温条件下筛选高粱种子萌发期耐低温种质资源时与大田实际有所偏差，选择低温处理条件时应慎重考虑。如表2和图1所示，8 ℃低温处理14 d后，对种子的相对萌发率影响较大，631份材料较均匀地分布在6个不同的等级中。然而对相对出苗率影响较小，主要集中在前3个等级中。这样初步筛选到的较优良材料数量较多，增加了进一步筛选的工作量。4 ℃低温处理14 d后，对种子的相对萌发率和相对出苗率影响都非常大，大部分材料种子都不能萌发，条件过于苛刻可能会遗漏优良的材料。因此，综合考虑相对萌发率和相对出苗率时，初步筛选高粱种子萌发期耐低温材料时选择6 ℃低温处理14 d为宜。

4 结论

利用从中国以及世界其他地区收集的631份高粱材料进行8 ℃低温胁迫处理，14 d后统计种子的相对萌发率和相对出苗率，相对萌发率达到一、二、三、四、五、六级的样品数分别为91、120、102、88、78、152份，所占总样品比例分别为 14.42%、19.02%、16.16%、13.95%、12.36%、24.09%；相对出苗率达到一、二、三、四、五、六级的样品数分别为308、157、72、45、34、15份，所占总样品比例分别为48.81%、24.88%、11.41%、7.13%、5.39%、2.38%；其中相对萌发率和相对出苗率都达到一、二、三、四、五、六级的样品数分别是49、39、20、7、2、5份，共计122份。

对8 ℃低温处理达到一级标准的49份材料进行6 ℃低温处理，14 d后统计相对萌发率和相对出苗率，相对萌发率达到一级16份、二级6份、三级6份、四级6份、五级1份、六级14份；相对出苗率达到一级14份、二级24份、三级7份、四级3份、五级1份，其中两者共有的材料分别为一级6份、二级2份。对6 ℃低温处理达到一级标准的6份材料进行 4 ℃ 低温处理，其中只有1份材料萌发，且6份材料相对出苗率与8、6 ℃相比显著降低。8 ℃低温处理对相对出苗率影响较小，加重了后续筛选压力。4 ℃低温处理对相对萌发率影响较大，大部分材料都不能萌发，容易遗漏部分优良的材料。因此，综合考虑萌发率和出苗率时，初步筛选高粱种子萌发期耐低温材料时选择6 ℃低温处理14 d较为适宜。

致谢：对本研究材料的提供方辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心、国际热带半干旱地区作物研究所、中国国家作物种质库中期库和通辽市农业科学研究院表示感谢。材料收集过程中得到了国家高粱产业体系首席专家邹剑秋老师的大力支持，特此感谢！

参考文献：

[1]Major D J，Hamman W M，Rood S B. Effects of short-duration chilling temperature exposure on growth and development of sorghum[J]. Field Crops Research，1982，5：129-136.

[2]Yu J M，Tuinstra M R. Genetic analysis of seedling growth under cold temperature stress in grain sorghum[J]. Crop Science，2001，41（5）：1438-1443.

[3]龚文娟，邹恒荣，杨玉梅. 高粱、玉米等几种作物种子萌发阶段的抗寒性鉴定[J]. 黑龙江农业科学，1980（4）：14-18.

[4]马世均，石玉学，隋丽君. 高粱种子萌发阶段耐寒性研究简报[J]. 辽宁农业科学，1981（6）：32-35.

[5]陈香兰，孙振东. 高粱耐冷性材料筛选鉴定研究[J]. 作物品种资源，1986（2）：29-31.

[6]陳香兰，孙振东，杨树存，等. 高粱耐冷性材料筛选鉴定研究总结[J]. 黑龙江农业科学，1985（5）：24-26.

[7]张桂香，史红梅，张海燕. 高粱耐冷性鉴定方法及指标的研究[J]. 天津农业科学，2012，18（2）：137-139.

[8]李淑芬. 高粱品种资源苗期和灌浆期的抗冷性研究——Ⅰ.抗冷性指标及鉴定结果[J]. 辽宁农业科学，1992（4）：23-26.

[9]Bekele W A，Fiedler K，Shiringani A A，et al. Unravelling the genetic complexity of sorghum seedling development under low-temperature conditions[J]. Plant Cell and Environment，2014，37（3）：707-723.

[10]Knoll J，Ejeta G. Marker-assisted selection for early-season cold tolerance in sorghum：QTL validation across populations and environments[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，116（4）：541-553.

[11]Knoll J，Gunaratna N，Ejeta G. QTL analysis of early-season cold tolerance in sorghum[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，116（4）：577-587.

[12]成慧娟，严福忠，马尚耀，等. 影响高粱种子出苗率下降的原因及预防措施[J]. 内蒙古农业科技，2011（4）：112.

[13]吕云生. 高粱粉种原因及其预防措施[J]. 农村实用科技信息，1998（6）：4.

[14]卢庆善. 高粱学[M]. 北京：中国农业出版社，1999：148-151.

[15]张桂香，史红梅，张海燕. 高粱耐冷种质的鉴定及利用评价[J]. 中国农学通报，2012，28（36）：87-91.

[16]Menezes C B，Ticona-Benavente C A，Tardin F，et al. Selection indices to identify drought-tolerant grain sorghum cultivars[J]. Genetics and Molecular Research，2014，13（4）：9817-9827.

[17]Morris G P，Ramu P，Deshpande S P，et al. Population genomic and genome-wide association studies of agroclimatic traits in sorghum[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（2）：453-458.

[18]Ma Y，Dai X Y，Xu Y Y，et al. COLD1 confers chilling tolerance in rice[J]. Cell，2015，160（6）：1209-1221.

[19]Silva-Neta I C，Pinho E V，Veiga A D，et al. Expression of genes related to tolerance to low temperature for maize seed germination[J]. Genetics and Molecular Research，2015，14（1）：2674-2690.

[20]Nejadsadeghi L，Maali-Amiri R，Zeinali H A，et al. Membrane fatty acid compositions and cold-induced responses in tetraploid and hexaploid wheats[J]. Molecular Biology Reports，2015，42（2）：363-372.

[21]Yu L，Yan J，Yang Y J，et al. Overexpression of tomato mitogen-activated protein kinase SlMPK3 in tobacco increases tolerance to low temperature stress[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，121（1）：21-34.

[22]陳 亮，楼巧君，孙宗修，等. 水稻低温发芽力的QTL定位[J]. 中国水稻科学，2006，20（2）：159-164.周棱波，汪 灿，张国兵，等. 播期、密度和施肥水平对糯高粱黔高7号产量及构成因素的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：84-88.