桑叶的微生态发酵

孙 琦, 孙庆元, 赵 悦, 李本富

(1.大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034; 2.大连隆凤祥生态农业科技有限公司,辽宁大连 116030)

桑叶的微生态发酵

孙 琦1, 孙庆元1, 赵 悦1, 李本富2

(1.大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034; 2.大连隆凤祥生态农业科技有限公司,辽宁大连 116030)

利用酵母菌、乳酸菌以及枯草芽孢杆菌按单菌和混合菌对桑叶进行微生态发酵。根据微生态桑叶发酵综合评价指数确定发酵菌和发酵条件。将该条件下发酵的桑叶用于制作鱼饵料,并观测对鱼生长的影响。结果表明,乳酸菌与酵母菌按1∶1比例混合、10%接种量、发酵温度35℃、60 h、p H为8、60%的含水量时,发酵综合评价指数最高。微生态桑叶发酵综合评价指数影响由高到低顺序为接菌量、含水量、发酵时间、发酵温度、p H。发酵桑叶可增加测试鱼的体质量和身长,同时可降低饲料系数。

微生态;桑叶;发酵

0 引 言

桑叶含有黄铜、氨基酸、蛋白质、多糖、钙等多种营养成分[1]。微生态桑叶发酵实质是利用枯草杆菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌,以桑叶为初级营养物形成的营养共生关系。发酵可降解桑叶中的大分子物质,并可降低桑叶中的碳氮比。黄静等[2]利用桑叶制备发酵动物饲料得到良好的效果。然而,微生态发酵产生CO2导致发酵物总量下降,蛋白和钙的相对含量可能增加,多糖损失,难以评价微生态发酵效果。本研究利用桑叶进行微生态发酵并提出综合评价指数,以期综合平衡并提高桑叶饲料中各项营养成分。

1 材料与方法

1.1 材 料

秋季桑叶,大连隆凤祥生态农业科技有限公司;酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌,大连工业大学菌种保藏室提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌液的制备

分别配制YEPD培养基、完全培养基及液体种子培养基后分别对酵母菌、乳酸菌以及枯草芽孢杆菌进行扩大培养。

1.2.2 微生态桑叶发酵条件的确定

分别取5 g干桑叶,按一定比例混合菌种接种和发酵条件进行微生态发酵,设3次重复。

乳酸菌和枯草芽孢杆菌菌数为109CFU/mL,酵母菌菌数为108CFU/m L,制成6种混合菌种。乳酸菌与酵母菌体积比1∶1(A);乳酸菌和酵母菌体积比3∶7(B);乳酸菌与枯草芽孢杆菌体积比1∶1(C);乳酸菌与枯草芽孢杆菌体积比7∶3 (D);酵母菌和枯草芽孢杆菌体积比1∶1(E);酵母菌与枯草芽孢杆菌体积比7∶3(F)。

在37℃、初始p H为7、含水量50%,分别按5%、10%、15%、20%、25%接种量接种,对桑叶进行48 h的发酵。

在初始p H为7、含水量50%,按所选接种量分别在20、25、30、35、40℃对桑叶进行48 h发酵。

在含水量50%,按所选接种量和发酵温度,分别在初始p H为4、5、6、7、8发酵48 h。

在含水量50%,按所选接种量、温度和初始p H,对桑叶分别进行12、24、36、48、60 h发酵。

按所选接种量、温度、初始p H和发酵时间,分别以30%、40%、50%、60%、70%的含水量对桑叶进行发酵。

1.2.3 微生态发酵桑叶中多糖的测定

取微生态发酵干桑叶粉末1 g,利用微波提取法提取桑叶多糖,利用苯酚-硫酸法[2]测定多糖。以未发酵的等量干桑叶粉末作对照,绘制标准曲线。按公式(1)计算桑叶中多糖的质量分数:

式(1)中:w1为多糖质量分数,%;ρ为样品溶液中葡萄糖质量浓度,mg/m L;V为样品的稀释体积,m L;f为多糖换算因子;m1为样品质量,mg。以葡萄糖为标准品,得回归方程:

式中:y为吸光度;x为多糖质量,μg。

1.2.4 微生态发酵桑叶中钙的测定

取微生态发酵干桑叶粉末0.2 g,利用高锰酸钾标准溶液法[4]对微生态发酵桑叶中的钙进行测定,以未发酵的等量干桑叶粉作对照。

按公式(2)计算桑叶中钙的质量分数:式(2)中:w2为钙的质量分数,%;c1为KMn O4摩尔浓度,mol/L;V为KMn O4的体积,m L;M为钙的摩尔质量,g/mol;m2为样品质量,g。

1.2.5 微生态发酵桑叶中蛋白质的测定

取微生态发酵干桑叶粉末3 g,采用凯氏定氮法测定蛋白质质量分数。将硼酸液用0.01 mol/L HCl标准溶液滴定至终点即灰紫色,以未发酵的等量干桑叶粉末作对照。

按公式(3)计算桑叶中蛋白质的质量分数:

式(3)中:w3为蛋白质的质量分数,%;为c2为盐酸标准溶液的浓度,mol/L;V1为空白滴定消耗标准液量,m L;V2为试剂滴定消耗标准液量, m L;m3为样品质量,g;F为蛋白质系数(一般为6.25);0.014为N的摩尔质量,g/mmol。

1.2.6 微生态发酵综合评价指数的计算

选取微生态发酵时间为48 h的发酵干桑叶测定多糖、钙和蛋白质质量分数,即确定3个评价指标。通过变异系数法[5]计算相应的权重和微生态发酵综合评价指数,确定最佳发酵条件。

式(5)、(6)中:σi表示第i项指标的标准差;Vi表示第i项指标的变异系数,即标准差系数;Ti表示各指标的权重。

1.2.7 微生态桑叶的应用

将微生态干桑叶粉末按质量分数0、20%、40%、60%、80%、100%混合到鱼食中[6],饲养孔雀、金球、黑玛丽于3个鱼槽中,每槽5条鱼。记录初始和处理鱼的体质量,喂食量控制在0.2 g/d,5 d为一个周期。每个周期后,通过测定鱼的增重率(WGR)、生长比率(SGR)以及饲料系数(FCR)来判断发酵桑叶的应用效果[7],用未发酵的等量干桑叶粉末作对照,重复3次。

式中:mt为饲养后鱼的体质量,g;m0为鱼的初始体质量,g;mf为饲料总消耗量,g;t为饲养时间,d。

2 结果与分析

2.1 微生态桑叶发酵综合评价指数分析

2.1.1 单个菌种对微生态桑叶发酵综合评价指数的影响

桑叶在微生态发酵后,与未接菌相对比,发酵综合评价指数明显增加;在接种乳酸菌时,综合评价指数为9.82,比接种酵母菌时的9.52及接种枯草芽孢杆菌时的9.35高。

2.1.2 混合菌种对微生态桑叶发酵综合评价指数的影响

如图1所示,桑叶在乳酸菌和酵母菌等体积混合时,综合评价指数为10.04,比接种其他组合菌显著增高。当乳酸菌和酵母菌等体积混合发酵时,发酵桑叶的综合评价指数比只接种乳酸菌时的综合评价指数高0.22,即乳酸菌与酵母菌等体积混合时的桑叶发酵综合评价指数最高。

2.1.3 不同发酵因素对桑叶发酵指数的影响

按“1.2.2”的方法,测定不同发酵因素对发酵指数的影响,结果如图2所示。由图2可以看出,在接种量为10%(图2(a))、35℃(图2(b))、培养时间为60 h(图2(c))、p H=8(图2(d))、含水量为60%(图2(e))时,发酵桑叶的综合评价指数最高,分别为10.27、9.71、9.8、9.67、9.88。

图1 不同比例混合菌种的微生态桑叶发酵综合评价指数Fig.1 CEI for two strains micro-ecological fermentation in different ratios of mulberry leaves

图2 不同发酵因素对微生态桑叶发酵综合评价指数的影响Fig.2 The effects of different fermentation factors on the CEI for micro-ecological fermentation of mulberry leaves

2.2 微生态桑叶对鱼生长情况的影响

2.2.1 发酵桑叶对鱼生长质量的影响

如表1所示,随着桑叶添加量逐渐增大,鱼的体质量均增大,当桑叶质量分数达到80%以上时,鱼的体质量增加量减小。

2.2.2 发酵桑叶对鱼增重率的影响

从图3中可以看出,发酵桑叶添加量为20%～60%时,3种鱼的平均增重率随桑叶添加的增加而增大,分别增加了2.27%、2.9%、3.04%;之后平均增重率逐渐减小,添加量为80%～100%时,3种鱼平均增重率增加了2.69%和0.74%。

2.2.3 发酵桑叶对鱼生长比率的影响

从图4中可以看出,发酵桑叶添加量为20%～60%时,3种鱼的平均生长比率随桑叶添加的增加而增大,分别增加了0.42%、0.54%、0.57%;之后平均生长比率逐渐减小,添加量为80%～100%时,3种鱼平均生长比率增加了0.52%和0.15%。

表1 发酵桑叶对鱼生长质量的影响Tab.1 The effects of the fermented mulberry leaves on the growth of fish

图3 发酵桑叶添加量对鱼增重率的影响Fig.3 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the weight growth rates of fish

图4 发酵桑叶添加量对鱼生长比率的影响Fig.4 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the growth ratios of fish

2.2.4 发酵桑叶对饲料系数的影响

图5 发酵桑叶添加量对饲料系数的影响Fig.5 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the feed coefficient index

从图5中可以看出,3种鱼的平均饲料系数随桑叶添加量的增加而增大,添加量在20%～80%,平均饲料系数依次减少了1.88%、2.78%、2.63%、7.47%、4.49%,发酵桑叶添加量为80%时饲料系数减少最大。

3 结 论

在乳酸菌和酵母菌等量接种、接菌量10%、培养温度35℃、发酵时间60 h、初始p H为8、含水量60%时,微生态发酵综合评价指数最高。微生态发酵综合评价指数可作为评价桑叶发酵程度的指标,对平衡发酵桑叶中多糖、钙及蛋白质含量有指导意义。将发酵桑叶应用于鱼饲料时,发酵桑叶可以加速鱼体的代谢及消化作用,使得鱼体对营养物质更好地吸收利用。

[1]吴宏忠,袁涛,徐继成,等.饲料营养成分对畜禽肉品品质的影响[J].饲料博览,2003(7):27-29.

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[3]李妍,魏建和,许旭东,等.苯酚-硫酸法定量测定桔梗多糖的研究[J].时珍国医国药,2009,20(1):5-7.

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Micro-ecological fermentation of mulberry leaves

SUN Qi1, SUN Qingyuan1, ZHAO Yue1, LI Benfu2
(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Dalian Long Phenix Eco-agricultural Technological Company Limited,Dalian 116030,China)

Solid microbial fermentations for mulberry leaves were conducted with yeast,lactobacillus and bacillus subtilis respectively or mixtures of their two.The strains and fermentation conditions were determined according to the comprehensive evaluation indexes(CEI)for micro-ecological fermentation of mulberry leaves.The fermented mulberry leaves were used in fish feed to examine their effects on fish growth.The results showed that the optimal fermentation conditions were 10%of inoculation with the equal amount of yeast and lactobacillus,35℃,60 h,p H 8,water content of 60%.The descending order of CEI was inoculation amount,water content,time,temperature,p H.The weights and sizes of tested fish increased when the fermented mulberry leaves used in feed,while the feed coefficient index decreased.

micro-ecological;mulberry;fermentation

Q939.96

A

1674-1404(2017)01-0019-04

2015-10-15.

孙琦(1990-),女,硕士研究生;通信作者:孙庆元(1957-),男,教授.

孙琦,孙庆元,赵悦,李本富.桑叶的微生态发酵[J].大连工业大学学报,2017,36(1):19-22.

SUN Qi,SUN Qingyuan,ZHAO Yue,LI Benfu.Micro-ecological fermentation of mulberry leaves[J].Journal of Dalian Polytechnic University,2017,36(1):19-22.