固态发酵红曲中多糖含量测定方法的比较研究

罗佳，严敏嘉，李小芳，何祖新，吴纯洁，*

（1.成都中医药大学，四川成都611137；2.四川得恩德药业有限公司，四川绵阳612000）

固态发酵红曲中多糖含量测定方法的比较研究

罗佳1，严敏嘉1，李小芳1，何祖新2，吴纯洁1，*

（1.成都中医药大学，四川成都611137；2.四川得恩德药业有限公司，四川绵阳612000）

建立苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸显色测定固态发酵红曲中可溶性多糖含量的方法，并进行两种方法的比较研究。固态发酵红曲采用水提取红曲多糖，所得多糖提取液用淀粉酶去除淀粉、Sevag试剂去除蛋白质，并经醇沉得到红曲多糖，再分别考察苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸法两种多糖含量测定方法的线性关系、重复性、稳定性、精密度、加样回收率等指标。苯酚-硫酸法在30μg～70μg范围内线性关系良好（R2=0.998 1），蒽酮-硫酸法在40μg～120μg范围内线性关系良好（R2=0.999 7）。两种方法学考察结果均较好，且测定红曲多糖的含量苯酚-硫酸法为2.51%，蒽酮-硫酸法为2.52%，两种方法结果相近。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法均能用于测定固态发酵红曲多糖含量。

红曲；多糖；含量测定；苯酚-硫酸法；蒽酮-硫酸法

红曲由红曲霉属真菌接种于大米发酵而成，是一种食疗兼备的传统中药。明代《本草纲目》记载：“红曲，性温、味甘，消食活血，健脾燥胃”[1]。近年来的研究表明红曲中的多糖成分具有抗癌[2]、抗肿瘤[3]、增强机体免疫力[4]等功能。但目前对固态发酵红曲中多糖的含量测定方法鲜有文献报道，为此本文采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定红曲多糖的含量，以期为红曲多糖的含量测定提供科学参考。

1 材料

1.1 原料

固态发酵红曲样品：由四川得恩德药业有限公司提供。

1.2 试剂

D（+）-无水葡萄糖（批号：MUST-15041507）：中国科学院成都生物研究所；α-淀粉酶：sigma公司；苯酚、蒽酮、浓硫酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷（均为分析纯）：成都市科化工试剂厂。

0.1 %蒽酮-硫酸试剂[5]：取0.1 g蒽酮溶于100mL冷却的80%硫酸溶液中，混匀，现配现用。

1.3 仪器

BP211D AG型电子天平：德国Satorius；电热恒温水浴锅：北京国华医疗器械厂；UV-6000型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；UPT-I-10T型超纯水器：成都超纯科技有限公司；SHZ-O（III）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪RE-2000B：上海亚荣生化仪器厂。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称定红曲细粉2.00 g，采用回流法水提多糖，提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液加入1%α-淀粉酶，于60℃水浴保温水解淀粉，直至提取液遇碘水不变蓝即淀粉水解完全，随后沸水浴加热5min灭活淀粉酶。再利用Sevag法去除提取液中的蛋白质，按体积比为5∶1（提取液：Sevag试剂）加入Sevag试剂，振摇后离心，上清液再加入Sevag试剂，重复操作直至无沉淀。

去除蛋白后的提取液浓缩至10mL，再加入无水乙醇使其乙醇体积分数达80%，醇沉24 h。醇沉后离心得到的沉淀即为红曲多糖。红曲多糖沉淀用水溶解并定容至50mL，即得供试品溶液。

2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

2.2.1 标准曲线的制备

葡萄糖对照品溶液的配制：精密称取经过105℃恒温干燥24 h的无水葡萄糖对照品10mg，定容至100mL容量瓶，摇匀即得0.1mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

标准曲线的绘制：精密量取葡萄糖对照品溶液0.0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，置具塞试管中，分别加水补至1.0mL，再加入5%的苯酚溶液1mL，然后迅速加入浓硫酸5mL，混匀，沸水浴反应15min后用冰水终止反应。以第一份为空白对照，紫外-可见分光光度法在485 nm处测定吸光度。以葡萄糖的含量（μg）为横坐标，以吸光度A为纵坐标，得到回归方程：y= 0.010 4x+0.007，R2=0.998 1（葡萄糖含量线性范围：30μg～70μg），结果见图1。

图1 苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线图Fig.1 Standard curve of glucose determination by phenol-sulfuric acid method

2.2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

精密量取供试品溶液1mL定容至50mL容量瓶，定容得待测样品液。精密量取1mL待测样品液置具塞试管中，加入5%苯酚水溶液1mL，然后迅速加浓硫酸5mL，混匀，沸水浴反应15min后冰水冷却终止反应，以水为空白同法显色为空白对照。

2.2.3 检测波长的确定

以水空白为对照，对葡萄糖对照品溶液和供试品溶液显色后在400 nm～800 nm波长范围进行扫描测定。结果确定两者在485nm有最大吸收，故确定485 nm为显色波长。

2.2.4 重复性试验

取同一批固态红曲粉末6份，样品按照2.1项下供试品制备的方法同时制备6份供试品溶液，照2.2.2项显色后分别测定其吸光度A，分别为：0.217、0.219、0.212、0.210、0.211、0.215，结果RSD值为1.80%。本方法重复性良好。

2.2.5 精密度试验

取一份供试品溶液，照2.2.2项显色后，连续测定其吸光度值6次。吸光度分别为：0.217、0.218、0.218、0.219、0.217、0.217，结果RSD值为1.29%。证明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取一份供试品溶液，照2.2.2项显色后，每隔10分钟测定其吸光度。结果在1h之内，吸光度值分别为：0.217、0.217、0.216、0.215、0.214、0.214，RSD值为1.13%。结果表明，样品液显色后在1 h内吸光度值基本稳定。

2.2.7 加样回收率试验

取同一批样品6份，依2.1项制备供试品溶液，照2.2.2项下显色测定供试品溶液多糖含量。然后取已知含量的供试品溶液加入相当含量的葡萄糖标准液，再同法测定多糖含量，并计算回收率。回收率结果如表1所示。

表1 苯酚-硫酸法加样回收率测定结果Table1 Sample recovery determination results of phenol-sulfuric acid method

2.3 蒽酮-硫酸法测定红曲多糖含量

2.3.1 标准曲线的制备

按照2.2.1项下配置0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL葡萄糖标准液至于具塞试管中，加水补至2.0mL，再加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL，混匀，沸水浴反应15min后冰水冷却15min终止反应，以第一份为空白，紫外-可见分光光度法在625 nm处测定吸光度，以葡萄糖的含量（μg）为横坐标，以吸光度A为纵坐标，得回归方程y= 0.004 6x-0.006，R2=0.999 7，（葡萄糖含量线性范围：40μg～120μg）结果见图2。

图2 蒽酮-硫酸葡萄糖标准曲线图Fig.2 Standard curve of glucose determination by anthronesulfuric acid method

2.3.2 蒽酮-硫酸法测定多糖含量

精密量取供试品溶液1mL定容至50mL容量瓶，定容得待测样品液。精密量取样品液2mL，加0.1%蒽酮-硫酸试剂6mL，迅速摇匀，沸水浴反应15min后冰水浴15min终止反应，以水为空白同法显色为空白对照。

2.3.3 检测波长的确定

以水空白为对照，对葡萄糖对照品溶液和样品溶液显色后在400 nm～800 nm波长范围进行扫描测定。结果表明两者在625 nm有最大吸收，故确定625 nm为检测波长。

2.3.4 重复性试验

取同一批固态红曲粉末6份，样品按照2.1项下供试品制备的方法同时制备6份供试品溶液，照2.3.2项显色后分别测定其吸光度A，结果为：0.179、0.181、0.178、0.180、0.177、0.179，重复性RSD值为0.79%。本方法重复性良好。

2.3.5 精密度试验

取一份供试品溶液，照2.2.2项显色后连续测定其吸光度值6次。结果为：0.179、0.179、0.18、0.178、0.178、0.178结果精密度RSD值为0.46%。仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

取一份供试品溶液，照2.2.2项显色后分别在每隔10min测定其吸光度。在1 h之内结果：0.179、0.179、0.177、0.176、0.175、0.174，RSD值为1.17%。结果表明，供试品溶液在1 h内吸光度值基本稳定。

2.3.7 加样回收率试验

取同一批样品6份，依2.1项下方法制备供试品溶液，照2.3.2项下显色测定供试品溶液多糖含量。然后取已知含量的供试品溶液加入相当含量的葡萄糖标准液，再同法测定多糖含量，计算回收率。回收率结果如表2所示。

表2 蒽酮-硫酸法加样回收率测定结果Table2 Sample recovery determination results of anthronesulfuric acid method

2.4 样品中多糖含量测定结果

取同一批样品3份按2.1项制备供试品溶液，分别按照2.2.2项下苯酚-硫酸法和2.3.2项下蒽酮-硫酸法显色测定吸光度，根据标准曲线，按照式（1）计算红曲多糖含量，结果见表3。苯酚-硫酸法测定红曲多糖含量平均值为2.51%，蒽酮-硫酸法的平均值为2.52%，两者的测定结果接近。

式中：B为根据标准曲线计算样品中葡萄糖的质量，μg；D为稀释倍数；f为单位换算因子；m为样品取样量，g。

表3 红曲多糖含量测定结果Table3 Results of the determination of the polysaccharide content of red yeast rice

3 讨论

固态发酵红曲以大米为发酵基质，其本身含大量的淀粉，在前期预试验中发现在提取多糖的同时也提取出了大量的淀粉，而淀粉在多糖含量测定时同样会被浓硫酸水解成单糖类物质而显色，极大影响测定结果的准确性。因此本研究采用α-淀粉酶去除提取液中的淀粉，并用Sevag法去除提取液中的蛋白质，尽量排除干扰，提高了含量测定结果的准确度。

本试验同时利用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定固态发酵红曲多糖含量，两种方法线性关系、精密度、稳定性、重复性均较好（RSD＜2%），加样回收率在95%～105%之间，同一批次红曲样品中苯酚-硫酸法测得红曲多糖平均含量为2.51%（n=3），蒽酮-硫酸法测定平均含量为2.52%（n=3），两种方法测定结果接近且无差异性，表明两种方法均能用于固态发酵红曲多糖的含量测定。

[1]李时珍.本草纲目[M].北京:人民卫生出版社,1975:1547

[2]Pengrong Wang,Danfeng Chen,Donghua Jiang,et al.Alkali extraction and in vitro antioxidant activity of Monascus mycelium polysaccharides[J].Journal of Food Science and Technology,2014,51(7): 1251-1259

[3]成晓霞,陈泽雄.红曲抗肿瘤活性研究进展[J].中国现代中药, 2011,13(3):43-45

[4]Chen Hung-Hui,Chen Yu-Yawn,Yeh Jay-Z,et al.Immune-stimulated antitumor effect of different molecular weight polysaccharides from Monascus purpureus on human leukemic U937 cells[J].CyTAJournal of Food,2014,12(2):134-140

[5]杨秀英,王书林.蒽酮-硫酸比色法测定枇杷叶中可溶性多糖的含量[J].亚太传统医药,2008,4(8):26-27

Compare Study on Quantity Determine Method of Polysaccharide of Red Yeast Rice

LUO Jia1，YAN Min-jia1，LI Xiao-fang1，HE Zu-xin2，WU Chun-jie1，*
（1.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，Sichuan，China；2.Sichuan Sino-Dandard Pharmaceutical Co.，Ltd.，Mianyang612000，Sichuan，China）

The establishment of quantity determine method of polysaccharide of red yeast rice by phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method was developed，and then two methods were compared.The polysaccharide was obtained with the water extraction from red yeast rice.The starch was removed from polysaccharide extracts by amylase，while the protein removed by Sevag reagent.Then the polysaccharide was obtained by ethanol precipitation.And then the study was taking on the linearity，repeatability，stability，precision and recovery index of phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method.The linearity of the phenol-sulphuric acid method（R2=0.998 1）was 30μg-70μg，and the anthrone-sulphuric acid method（R2=0.999 7）was40μg-120μg.The results of the two methods were good，and the determination of the polysaccharide content of red yeast rice by the two methods was 2.51% and 2.52%.The results of the two methods were similar. The phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method can be used for the determination of the polysaccharide content of red yeast rice.

red yeast rice；polysaccharide；quantity determine；phenol-sulfuric acid method；anthronesulfuric acid method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.028

2016-11-08

国家中医药管理局公益性行业科研专项（201507004）；四川省科技厅苗子工程项目（2016RZ0037）

罗佳（1985—），女（汉），讲师，在读博士研究生，研究方向：中药炮制制剂。

*通信作者：吴纯洁，研究员，博士生导师，研究方向：中药炮制制剂。