史氏鲟鱼软骨提取物提取工艺及促创面愈合的研究

饶秋华，罗土炎，曹治云，罗 钦，李弈君，王少珍，张志灯

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,福建省精密仪器农业测试重点实验室 350003； 2.福建中医药大学中西医结合研究院；3.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心)

鲟鱼是世界上唯一生活在水中的活化石，是所有鱼类中营养价值最高的一种鱼类。目前，中国是鲟鱼养殖最多、分布最广、总产量最高的国家，鲟鱼全身遍布软骨，鲟鱼头、脊索及鳍中含有的软骨约占体重的10%。软骨又称明骨、鱼脑，是软骨鱼类鲟鱼、鲨鱼特有的组织，除供食用外，还具有独特的保健药用功效。本草拾遗记载：鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳、延年益寿。软骨组织中含丰富的硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，以下称“CS”)，它是一种酸性黏多糖(糖胺多糖)，具有降血脂、抗动脉硬化、消炎镇痛、恢复关节活动能力、增强人体软骨弹性、抗衰老、耐疲劳等功效，因此软骨提取物是一种很好的药用来源[1-2]。

创面是正常皮肤(组织)在外界致伤因子， 如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温，以及机体内在因素，如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性破坏、一定量正常组织丢失和皮肤正常功能受损。每年全国受交通事故、意外跌落、动物咬伤、外科手术、战争等因素导致的创伤人群多达数百万人，创伤成为不可忽视的疾病。因此，促进创面愈合就成为创伤防治的重要手段[3]。目前，用于创面愈合的药物主要有维生素类，如维生素C、维生素B12、维生素B2、维生素B6、泛酸等；微量元素类，如锌制剂类；中药等有效成分，如七叶皂苷钠、壳聚糖等。然而上述产品获得过程复杂，需要不断地提取和纯化，生产成本高[4]。本研究从饲养史氏鲟鱼(主要产品为鱼子酱)的副产物——软骨提取物具有消炎镇痛功效的角度出发，探讨鲟鱼软骨提取物对促创面愈合的功效，对进一步研究其生理功能和开拓鲟鱼软骨素应用市场具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1鲟鱼 取自福建省农业科学院福清渔溪养殖基地的鲟鱼，体重8.5 kg、体长91 cm。

1.1.2主要试剂 无水乙醇,天津市北辰方正试剂厂产品；氢氧化钠，西陇化工股份有限公司产品；氯化钠，天津市福晨化学试剂厂产品；硼砂，天津市恒兴化学试剂制造有限公司产品；咔唑，国药集团化学试剂有限公司产品；D-葡萄糖醛酸，国药集团化学试剂有限公司产品；胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司产品；硫酸，天津市福晨化学试剂厂产品。

1.1.3仪器与设备 电热恒温水浴锅：DK-S16型，上海森信实验有限公司产品；酸度计：pHS-25型，上海理达仪器厂产品；电动搅拌器：SG-3040型，上海硕光电子科技有限公司产品；离心机：LXJ-II型，上海医用分析仪器厂产品；电子天平：JA2002型，上海精天电子仪器厂产品；电热恒温鼓风干燥箱：DH9-9075A型，上海一恒科技有限公司产品；紫外可见分光光度计：TU-1800PC型，北京普析通用仪器有限公司产品。

1.1.4SPF级昆明小白鼠 6只，雄雌各3只，体重(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1试品溶液制备 精确称取用不同方法所提取的CS样品0.002 g于10 mL容量瓶中，水溶解定容。

1.2.2对照品溶液制备 精确称取D-葡萄糖醛酸标准品0.002 g于10 mL容量瓶中，水溶解定容。

1.2.3咔唑试剂 精确称取0.0125 g咔唑于10 mL棕色容量瓶中，无水乙醇溶解定容，置于4℃冰箱保存。

1.2.4硼砂-浓硫酸试剂 精确称取0.477 g四硼酸钠，置于50 mL棕色容量瓶中，用浓硫酸溶解并定容，置于4℃冰箱保存。

1.2.5试品溶液的测定 精确量取5.0 mL硼砂-浓硫酸试剂于试管中，加入1.0 mL试品溶液，于沸水浴中加热10 min，取出迅速冷却至室温。向水解液中加入咔唑试剂0.2 mL，摇匀，置于沸水浴中加热15 min，取出后冷却至室温。在530 nm波长处测定吸光度。

1.2.6前处理 将鲟鱼置于电磁炉中加水煮熟，剔除鲟鱼上的鱼肉等杂质，置于烘箱中烘干，用高速中药粉碎机将软骨进行粉碎，粉碎后转至1000 mL烧杯中，加 95%乙醇浸泡24 h，移出乙醇，重复浸泡1次。于50℃鼓风干燥脱脂、备用[5]。

1.2.7CS的提取纯化 准确称取脱脂处理后鲟鱼软骨粉2.0000 g于50 mL烧杯中，加入12 mL 6%氢氧化钠溶液，40℃水浴降解3 h。取出水解液，将其pH值调至中性后于 3000 r/min离心 10 min。离心后的碱提取液加入4%(W/V)氯化钠，待氯化钠完全溶解后于90℃水浴降解20 min，反应后冷却，3000 r/min离心10 min。取离心上清液调节pH值至8.2，加入0.5%胰蛋白酶，于40℃水浴中酶解3 h。然后，于90℃水浴15 min，使胰蛋白酶失活，冷却后3000 r/min离心10 min。取离心后的上清液，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，搅匀，沉淀CS；回收乙醇后，以3%氯化钠溶液(增加离子强度)溶解得到的CS沉淀，再缓慢加入3倍体积的无水乙醇，搅匀，沉淀CS，回收乙醇。将经过乙醇二次沉淀的CS置于50℃真空干燥箱干燥，最后将干燥好的CS研碎成小颗粒[6-10]，供促创面愈合试验之用。试验预先设计3个单因素试验(酶解温度、酶用量、酶解pH值)，每个因素筛选3个高CS纯度的水平值，设计三因素三水平正交试验，探索最优的酶解提取工艺组合。

公式说明：CS中葡萄糖醛酸占45.12%。

1.2.8促创面愈合 鲟鱼软骨提取物用双蒸馏水溶解，配制成80 mg/mL的鲟鱼软骨素提取物水溶液；空白对照组用生理盐水。小白鼠用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，剪毛处理，碘伏消毒，在小白鼠颈背部中央制造4个纵行长1 cm的皮肤全层切口，左侧和右侧各2个创口，单只分笼饲养，建立损伤模型。模型建立后，小白鼠右侧创口用鲟鱼软骨提取物水溶液，按每只0.1 mL的剂量涂抹于相应组小白鼠的创口(外延至2.0～3.0 mm，厚度约0.5 mm)，左侧创口涂生理盐水，然后两侧创口均涂抹红霉素软膏，共持续观察21 d。

2 结果与分析

2.1 单因素分析

2.1.1酶解温度 为了探讨不同酶解温度对CS纯度的影响，按照CS提取纯化的步骤(1.2.7)，酶解的温度分别设为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行试验，结果见表1。

表1 酶解温度对CS纯度的影响

由表1可以看出，酶解温度在40℃时提取的CS纯度最高，CS纯度较高的3个酶解温度为40℃、50℃、60℃。

2.1.2酶解pH值 为了探讨不同酶解pH值对CS纯度的影响，按照CS提取纯化的步骤1.2.7，酶解的pH值分别设为6.7、7.2、7.7、8.2、8.7、9.2、9.7进行试验，结果见表2。

由表2可以看出，酶解pH值在8.2时CS纯度最高，CS纯度较高的3个酶解pH值为7.7、8.2、8.7。

表2 酶解pH值对CS纯度的影响

2.1.3酶的用量 为了探讨不同酶的使用量对CS纯度的影响，按照提取纯化的步骤1.2.7，酶的用量分别设为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%进行试验，结果见表3。

表3 酶的用量对CS纯度的影响

由表3可以看出，酶的用量在0.5%时CS纯度最高,CS纯度较高的3个酶量为0.3%、0.5%、0.7%。

2.2 正交试验

为了筛选出最优的酶解提取CS工艺组合，采用正交试验法筛选最佳提取工艺。根据单因素试验的酶解温度取40℃、50℃、60℃ 三个水平，酶量取0.3%、0.5%、0.7% 三个水平，酶解pH值取7.7、8.2、8.7 三个水平。以CS纯度为指标，进行正交试验(表4)。

表4 正交试验各处理的酶解温度、酶量及酶解pH值

将样品1～9进行CS纯度测定，其纯度计算结果见表5。

将正交试验结果通过DPS软件进行方差分析，可得影响CS纯度的最重要因素是酶解温度，次要因素是酶量与酶解pH值。再通过均值的比较发现，酶解温度40℃、酶量0.5%、酶解pH值在8.2时，CS的纯度最高，为59.07%。

表5 不同因素不同水平对史氏鲟鱼CS纯度的影响

2.3 创面愈合观察

术后于第5 d、10 d、15 d、20 d观察记录创口的出血量及局部情况，创口愈合时间及愈合创面的特征(表6、图1、图2、图3)。试验结果表明，用鲟鱼软骨提取物水溶液涂抹的小白鼠创口比用生理盐水涂抹的早愈合，生成的疤痕不明显，再生皮肤光滑如常；给药后15 d创口愈合，给药后20 d创口皮肤有毛发新生；生理盐水涂抹处理的创口愈合较晚，再生皮肤较粗糙，无毛发生长。

表6 小白鼠创口愈合情况 (单位： mm)

注：*表示与CK相比差异达显著水平，**表示与CK相比差异达极显著水平。

3 结论与讨论

鲟鱼全身是宝，肉质鲜美，尤其是鲟鱼的头、脊索、鳍中软骨占鱼体的10%左右，为硫酸软骨素的开发提供了丰富的来源。我国已成为世界鲟鱼第一养殖大国，故以鲟鱼软骨为原料提取硫酸软骨素可有效缓解鲨鱼资源枯竭带来的危机，有利于保护珍稀动物[11]。

图1 给药后10 d创口愈合情况

图2 给药后15 d创口愈合情况

图3 给药后20 d 创口愈合情况

研究表明，硫酸软骨素在心血管疾病、关节病的防治方面具有一定疗效，其保健药品常见用于防止冠心病、心绞痛、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血等疾病的发生，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率，对肿瘤也具有抑制作用；硫酸软骨素也是国内外流行的化妆品和医药品的重要原料。目前，家畜、鲨鱼类的动物是主要的软骨来源。但家畜的软骨产量很低，鲨鱼多是靠天然捕获，其来源受到资源的限制以及季节的影响[12]。

本试验在已有报道的碱提-酶解法的基础上，借鉴前人的优化提取工艺(碱提工艺)——倍量6%NaOH为溶剂，于40℃的水浴中搅拌提取4 h[5]，选择还未系统研究的酶解工艺进行工艺优化研究。经单因素试验及正交试验，进行硫酸软骨素的酶解方法优化试验，表明在酶解温度40℃、酶量0.5%、酶解pH值8.2时，硫酸软骨素的纯度最高，为59.07%，高于前人40.65%的研究结果[6]。

本试验在前期提取工艺基础上进行优化后获得鲟鱼软骨提取物(主要成分为硫酸软骨素)。据查询，以鲟鱼软骨提取物进行促创面愈合研究尚未见相关报道。因此，本研究进一步对提取物的促创面愈合效果进行了小白鼠活体试验。经过20 d 的观察，发现鲟鱼软骨提取物能够有效促进创面愈合，并促使小白鼠毛发再生，这可能与硫酸软骨素具有抗炎镇痛作用有关[13]。

关于硫酸软骨素的促伤口愈合的报道仅见使用小猪皮提取的胶原与葡甘聚糖和硫酸软骨素复合改性制成复合膜[14]，芦荟凝胶的胶原—壳聚糖—硫酸软骨素三元膜[15]对皮肤缺损及三度烧伤的创面治疗的研究报道，认为胶原作为细胞外基质蛋白，硫酸软骨素等多糖作为大分子基质成分除了可促进伤口愈合、诱导皮肤再生、无红肿热痛的作用外，也可能通过表达过氧化物歧化酶清除创口内自由基，减少促炎性因子，如TNF家族、IL家族等的生成，进而促进伤口愈合。本研究观察到鲟鱼软骨提取物具有促进创面愈合的作用，具体的作用机制有待后续研究。

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