速溶绿茶酶促氧化工艺试验研究

李丽霞，罗学平，何春雷

（1.宜宾职业技术学院生物与化工工程系，四川宜宾644003；2.四川省茶业科学与工程重点实验室，四川成都611130；3.四川农业大学园艺学院，四川成都611130）

速溶绿茶酶促氧化工艺试验研究

李丽霞1，2，罗学平1，何春雷2，3，*

（1.宜宾职业技术学院生物与化工工程系，四川宜宾644003；2.四川省茶业科学与工程重点实验室，四川成都611130；3.四川农业大学园艺学院，四川成都611130）

利用茶鲜叶制得的茶叶多酚氧化酶复合酶，开展速溶绿茶酶促氧化研究。以速溶绿茶中儿茶素转化率为指标，采用单因素试验，考察酶液浓度、底物浓度、pH值、温度和时间5个因素对速溶绿茶酶促氧化效果的影响，并通过正交试验法优化最佳酶促氧化条件。结果表明，速溶绿茶较优的酶促氧化条件为：酶促反应体系中茶叶复合酶浓度为2.0%，速溶绿茶浓度为0.5%，反应体系pH3.5，温度45℃，反应时间2.5 h。在此工艺参数下，儿茶素转化率为34.79%。速溶绿茶酶促氧化产物在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰，与红茶中的茶色素吸收光谱一致。速溶绿茶酶促氧化产物中茶黄素含量达14.68%，显著高于红茶提取物。

速溶绿茶；酶促氧化；茶叶复合酶；儿茶素；茶色素

速溶绿茶是茶叶深加工的重要产物[1]，由低档绿茶热水浸提喷雾干燥制得[2-3]，成本低廉。速溶绿茶是瓶装茶饮料的主要原料，其应用范围相对单一。数据显示，速溶绿茶的内含成分丰富，含有大量的茶多酚、儿茶素、氨基酸、咖啡碱等，尤其是茶多酚含量可达53.40%～72.07%[4]，是普通绿茶的3倍～4倍，因此，开展速溶绿茶深度加工和应用具有重要的价值。

茶多酚的主要氧化产物是茶黄素、茶红素以及茶褐素等，总称为茶色素[5-6]，具有重要的生理活性。研究表明，茶色素具较强的抗氧化功能和清除自由基的能力[7-8]。此外，茶色素能防治心脏病、高血压、高血脂等心血管疾病[9-10]，还有较强的抗癌、抗肿瘤等作用[11-12]，已在临床中应用[13]。

茶色素主要从红茶中提取[14-15]，但是红茶中的茶黄素含量较低，茶色素得率较低；或化学氧化高纯度的茶多酚制得[5-6，16-17]，但存在原料成本高及副产物多等不足；或采用酶促氧化，即利用多酚氧化酶催化高纯度的儿茶素氧化[17-18]，成本较高。因此，获取茶黄素含量高、副产物少的茶色素已经成为了茶学、医学和食品科学研究的重要课题。

因此，本研究以速溶绿茶为原料，以鲜叶中的多酚氧化酶复合酶为催化剂，酶促氧化制备茶色素，并对酶促氧化条件进行优化，以期为茶色素的低成本、高产出提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

速溶绿茶：四川省茶业科学与工程重点实验室提供，儿茶素总量为29.88%；茶叶复合酶：宜宾职业技术学院生物工程系实验室自制。

JJ-2组织匀浆机（常州金坛）、THZ-82恒温水浴振荡器（常州智博瑞）、723分光光度计（上海精科）、UV2300紫外分光光度计（上海天美）、DZF-6050电热恒温真空干燥箱（上海一恒）、SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（河南予华）、RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣）。

香兰素、乙酸乙酯、乙醇、浓盐酸、无水硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、丙酮：均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 茶叶复合酶的制备

茶叶复合酶按如下方法制备。

所得的丙酮干粉即为茶叶复合酶，其主要作用部分是多酚氧化酶。称取丙酮干粉10.00 g，用pH5.6的柠檬酸缓冲液配制成8%左右的浓度，密封，25℃条件下于震荡器上震荡45min后抽滤，滤液用pH5.6的柠檬酸缓冲液定容到100mL，即为10%的粗酶液，测定多酚氧化酶活性为2.1U。

粗酶液钝化：取粗酶液100mL于100mL容量瓶中，置于100℃水浴锅中煮沸2min，冷却后定容至刻度即可。

1.2.2 速溶绿茶酶促氧化工艺参数优化

1.2.2.1 单因素试验

在100mL速溶绿茶溶液中添加一定体积的酶溶液，以儿茶素氧化转化率为指标，分别就酶液浓度、底物浓度、pH、温度和酶促反应时间等因素开展单因素实验，重复3次。

在单因素试验基础上，综合考虑各因素，选取底物浓度、pH值、温度和酶促反应时间4个因素，以儿茶素氧化转化率为指标，进行L9（34）正交表进行试验设计，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table1 The designs of orthogonal experiment factor and level

1.2.3 茶色素的制备

将优化工艺参数下的反应液钝化酶活性后过滤，滤液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层再用等体积的pH8.0磷酸盐缓冲液洗涤1次，乙酸乙酯层经旋转蒸发仪浓缩、真空干燥后即为速溶绿茶酶促氧化产物。同时，以红茶茶汤为对照，按上述方法制备红茶中的茶色素。

1.2.4 儿茶素氧化转化率的计算儿茶素酶促氧化转化率按如下公式计算：

式中：C0为反应前溶液中的儿茶素浓度，mg/L；C1为反应结束后溶液中的儿茶素浓度，mg/L；C2为对照溶液（钝化后的酶液代替酶液）反应结束后的儿茶素浓度，mg/L。

1.2.5 检测方法

取待测氧化产物样品0.05 g，溶于100mL乙酸乙酯溶液中，于250 nm～500 nm处测定其吸收光谱。

式中：表示径流量观测值；表示BP神经网络对径流量的模拟值；表示该场洪水径流量的平均值；N表示观测值的个数。NSE的取值为-,1，NSE的值越接近1则表示模型的模拟度越高，模型的可信度越高。

茶叶复合酶中PPO活性采用文献[19]的方法测定，儿茶素测定方法采用盐酸香兰素显色法[20]，茶多酚含量测定采用酒石酸铁比色法[21]，咖啡碱含量测定采用紫外分光光度法[22]，茶黄素、茶红素含量测定采用系统分析法[23]。

2 结果与分析

2.1 不同因素对酶促氧化效果的影响

影响酶促氧化的因素很多，本实验仅从酶液浓度、底物浓度、pH值、温度和酶促反应时间5个方面对速溶绿茶酶促氧化效果进行探讨。

2.1.1 酶液浓度

称取0.5g速溶绿茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分别加入不同体积的酶溶液，用pH4.0柠檬酸缓冲液调整体积至100mL，使溶液中酶浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%，然后在40℃水浴中反应2 h。酶浓度对儿茶素氧化转化率的影响见图1。

图1 酶液浓度对酶促氧化效果的影响Fig.1 The influence of enzyme liquid concentration on enzymatic oxidation

统计表明，不同酶液浓度对酶促氧化效果影响差异极显著（F=942.424＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01），当酶液浓度低于2.0%时，酶液浓度与酶促氧化效果具有量效关系，但当酶液浓度超过2.0%时，儿茶素的氧化转化率不再增加。因此，酶液浓度以2.0%为宜。

2.1.2 底物浓度

儿茶素酶促氧化底物包括速溶绿茶浓度和氧气浓度，其中氧气源自空气，因此底物浓度仅考虑速溶绿茶浓度。称取0.1 g～1.0 g速溶绿茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分别加入20mL浓度为10%的酶液，用pH4.0柠檬酸缓冲液调整体积至100mL，然后在40℃水浴中反应2 h。底物浓度对儿茶素酶促氧化效果的影响见图2。

在不同底物浓度的酶促氧化体系中，茶汤颜色随浓度变化为黄、橙黄、橙红，表明儿茶素氧化转化成了红色物质。统计表明，底物浓度对酶促氧化效果影响差异极显著（F=265.539＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01）。当底物浓度在0.1%～0.5%时，儿茶素氧化转化率在26.37%～ 30.18%之间，但当底物浓度达到0.6%时，儿茶素氧化转化率显著下降，这可能是体系中多酚类浓度较高而抑制酶活性所致[19]。因此，酶促氧化体系中底物浓度以0.5%较为适宜。

图2 底物浓度对酶促氧化效果的影响Fig.2 The influence of substrate concentration on enzymatic oxidation

2.1.3 反应体系pH值

称取0.5 g速溶绿茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分别加入20mL浓度为10%的酶液，用pH3.5～pH7.0柠檬酸缓冲液调整体积至100mL，然后在40℃水浴中反应2 h。不同pH值对儿茶素酶促氧化效果的影响见图3。

图3 pH值对酶促氧化效果的影响Fig.3 The influence of pH on enzymatic oxidation

统计表明，pH对酶促氧化效果影响差异极显著（F=31.906＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01），其中当反应体系为pH4.0时，儿茶素转化率最高，当pH值低于4.0或高于4.5时儿茶素的转化率都趋于下降。因此，速溶绿茶酶促氧化体系以pH4.0较为适宜。

2.1.4 反应温度

称取0.5 g速溶绿茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分别加入20mL浓度为10%的酶液，用pH4.0柠檬酸缓冲液调整体积至100mL，然后在30℃～55℃水浴中反应2 h。不同反应温度对酶促氧化效果的影响见图4。

图4 温度对酶促氧化效果的影响Fig.4 The influence of temperature on enzymatic oxidation

酶对不同底物有不同的最适温度，一般植物中酶的最适温度在40℃～50℃之间[14]。在本试验中，儿茶素酶促氧化转化率随温度升高而增加，其中以45℃时达到最高值；当温度高于50℃时，儿茶素酶促氧化转化率逐渐下降。因此速溶绿茶溶液酶促氧化的最适温度是45℃。

2.1.5 反应时间

称取0.5 g速溶绿茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分别加入20mL浓度为10%的酶液，用pH4.0柠檬酸缓冲液调整体积至100mL，然后在40℃水浴中氧化1 h～5 h。不同反应时间对酶促氧化效果的影响见图5。

图5 反应时间对酶促氧化效果的影响Fig.5 The influence of reaction time on enzymatic oxidation

从图可知，当速溶绿茶酶促氧化2 h以后，儿茶素转化率区域平缓，这可能与酶活力下降有关。因此，速溶绿茶酶促氧化时间以2 h为宜。

2.2 酶促氧化工艺参数优化

为了进一步优化速溶绿茶酶促氧化工艺条件，在单因素试验的基础上，在反应体系中酶液浓度为2.0%的条件下，选取底物浓度（0.4%～0.6%）、反应体系pH（3.5～4.5）、反应温度（40℃～50℃）和反应时间（1.5 h～2.5 h）4个因素进行正交试验。试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 速溶绿茶酶促氧化工艺正交试验结果Table2 The orthogonal experiment results

表3 正交试验结果方差分析Table3 The variance analysis of orthogonal experiment results

由极差值R来看，正交试验所考查的4个因素对儿茶素转化率的影响程度依次为A（底物浓度）＞B（pH）＞D（反应时间）＞C（反应温度）。

由k值可知，在反应体系中酶液浓度为2.0%的条件下，速溶绿茶酶促氧化最佳工艺组合为A2B1C2D3，即：底物浓度0.5%，反应体系pH为3.5，温度45℃，酶促氧化时间为2.5 h。

经方差分析表明（表3），在不考虑交互效应的情况下，底物浓度、pH和反应时间3个因素对儿茶素转化率的影响达极显著水平（P≤0.01），反应温度对儿茶素转化率的影响达显著水平（P≤0.05）。

在获得正交试验结果后，按照最佳工艺组合进行3次验证试验，儿茶素的转化率分别为34.38%、34.95%、35.05%，平均为34.79%。

2.3 酶促氧化产物吸收光谱与成分分析

对速溶绿茶的酶促氧化产物乙酸乙酯萃取液真空干燥后，所得产品为粉红色固体粉末，色泽均匀，溶解性能良好。该产物在250 nm～500 nm处的吸收光谱与红茶中的茶色素吸收光谱相似，在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰（图6），且该吸收光谱与李立祥等[14]试验结果一致，说明酶促氧化速溶绿茶能生成茶色素。在紫外部分，茶色素呈马鞍型的吸收光谱。

图6 速溶绿茶酶促氧化产物吸收光谱图Fig.6 Absorption spectrum curve of the enzymatic oxidation product of instant green tea

速溶绿茶酶促氧化产物的主要内含成分见表5。

表5 速溶绿茶酶促氧化产物内含成分Table5 The biochemical composition of the enzymatic oxidation product of instant green tea

从表5可知，速溶绿茶酶促氧化产物中茶黄素含量高达14.68%，显著高于红茶提取物，此外还富含茶多酚、儿茶素等重要成分。

3 结论与讨论

速溶绿茶在茶叶复合酶的作用下，速溶绿茶中的儿茶素等首先被氧化成为邻醌，邻醌不稳定，很容易发生非酶次级氧化。相同的儿茶素邻醌或没食子儿茶素邻醌容易二聚合形成联苯酚醌，联苯酚醌进一步氧化、缩合形成茶黄素[1，24]。茶黄素是茶色素的主要功能成分，因此，利用茶叶复合酶，可催化氧化速溶绿茶制备茶色素。

通过单因素试验，考察酶液浓度、底物浓度、pH值、温度和时间5个因素对速溶绿茶酶促氧化效果的影响，并通过正交试验法对最佳酶促氧化条件优化。在酶促反应体系中，速溶绿茶较优的酶促氧化条件为：茶叶复合酶浓度为2.0%，速溶绿茶浓度为0.5%，反应体系pH为3.5，温度45℃，时间2.5 h。在此工艺参数下，儿茶素平均转化率为34.79%。速溶绿茶酶促氧化产物在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰，其紫外吸收光谱呈马鞍形，与红茶中的茶色素吸收光谱一致。速溶绿茶酶促氧化产物中茶黄素含量达14.68%，显著高于红茶提取物。

酶促氧化制取茶色素通常是在水介质中进行，其中儿茶素与氧是反应底物，而在水介质系统中的溶氧量很低（12mg/L～52mg/L）[25]，因而溶氧量低是茶色素形成的重要限制因子。此外，反应体系中的儿茶素浓度较低，但提高儿茶素浓度则其转化率显著降低，出现这种现象的原因可能是由于茶多酚、氨基酸、咖啡碱和蛋白质等物质达到一定浓度时，产生大量的疏水键，以致转化率降低。因此，在增加底物浓度的情况下，如何提高儿茶素的转化率和茶色素的得率还有待进一步探索。

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Experimental Study on the Enzymatic Oxidation of Instant Green Tea

LI Li-xia1，2，LUO Xue-ping1，HE Chun-lei2，3，*
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Yibin Vocational and Technical College，Yibin 644003，Sichuan，China；2.Key Laboratory of Tea Industry Science and Engineering of Sichuan Province，Chengdu 611130，Sichuan，China；3.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，Sichuan，China）

The compound enzymes were prepared from fresh tea leaves，and instant green tea was enzymatic oxidized by the compound enzymes in this article. The oxidation degree of catechins in instant green tea was set as evaluation index，single factor experiment was used to analyze the influence of five factors including concentration of compound enzymes，concentration of substrate，pH，temperature and reaction time on the effect of enzymatic oxidation，and the best conditions of enzymatic oxidation were optimized by orthogonal test. The results showed that the optimal enzymatic oxidation conditions of instant green tea as follow：in the enzymatic reaction system，the concentration of compound enzymes was 2.0 %，concentration of substrate was 0.5 %，the pH of system was 3.5，the temperature was 45 ℃ and the reaction time was 2.5 h. Under the conditions，the oxidation degree of catechins was high to 34.79 %. There existed four maximum spectral absorption peaks at 265，300，380 nm and 460 nm in the enzymatic oxidation products of instant green tea，and that was similar to the absorption spectrum of tea pigment in black tea. The content of theaflavins in enzymatic oxidation products of instant green tea was high to 14.68 %，and it was higher than that of black tea extract.

instant green tea；enzymatic oxidation；tea compound enzymes；catechins；tea pigment

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.003

2016-04-25

四川省教育厅科技基金项目（15ZB-0496）；宜宾市自然科技基金项目（2014NY-019）

李丽霞（1983—），女（汉），讲师，硕士研究生，从事茶叶深加工教学与研究工作。

*通信作者