低温胁迫对意大利蜜蜂受精卵的孵化率和发育历期的影响

陈 琳，徐新建，朱翔杰，周姝婧，王 青，郝振帮，周冰峰

(福建农林大学蜂学学院，福州 350002)

低温胁迫对意大利蜜蜂受精卵的孵化率和发育历期的影响

陈 琳，徐新建，朱翔杰，周姝婧，王 青，郝振帮，周冰峰*

(福建农林大学蜂学学院，福州 350002)

蜜蜂是典型的模式昆虫，也是重要的经济昆虫，温度对其发育有着重要的影响。本文研究了低温20℃处理不同时长对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica0-66 h受精卵的影响。结果表明：低温处理导致意大利蜜蜂受精卵的孵化率下降，发育历期显著延长。低温对蜜蜂受精卵孵化率影响程度与卵龄关系较大。0-9 h卵龄对低温敏感，其次是12-24 h卵龄，36 h以上卵龄后则较耐低温。0-66 h的卵受低温影响后发育历期延长平均值与低温胁迫时间呈显著的线性正相关。低温对蜜蜂卵发育有影响，在蜜蜂饲养管理的早春增长阶段，需要加强蜂群的保温。

意大利蜜蜂; 受精卵; 温度; 孵化率; 发育历期

温度是限制昆虫等变温动物生命活动的最重要条件之一，每种昆虫都有其温度生态位，即最适温度和耐受温度范围。温度超出了昆虫的耐受范围，其生命活动会受到抑制甚至是死亡(丁岩钦，1994；彩万志等，2011；陈红松，2012)。蜜蜂是重要的经济昆虫，对维持生态平衡起着重要的作用。长期进化过程中，蜜蜂个体发育依赖蜂群内稳定的巢温条件，体现了蜂子发育狭温性特点(周冰峰，2002a；Kleinhenzetal.，2003；Jonesetal., 2005；Becher，2010)。蜜蜂个体发育过程中的温度条件是蜜蜂发育重要的生态因素，研究蜜蜂蜂子发育和温度关系，对了解蜜蜂发育与环境关系具有重要的意义(Jacquesetal.，2012)。

恒定温度对蜜蜂卵发育影响的研究发现，在31℃-38℃范围内蜜蜂卵可以孵化(曾志将，1989a,1989b；周冰峰等，2002b)，在34℃-36℃内蜜蜂卵的孵化率高于90.00%，发育历期随着温度升高而缩短(周冰峰，2002b)。意大利蜜蜂工蜂封盖子的发育温区为29℃-37℃，中华蜜蜂工蜂封盖子的发育温区为31℃-37℃(朱翔杰等，2006)，尽管在发育温区内，蜜蜂封盖子能够羽化，但只在35℃±0.5℃下羽化成蜂在外部形态、神经发育、行为表现等方面最好，偏离这个温度，均受到影响。在29℃下发育的意蜂封盖子，全部发育畸形，在33℃、36℃条件下发育的封盖子，翅、吻和背板的长度均明显减小(朱翔杰等，2006)。在34.5℃条件下羽化的工蜂，大脑蕈状体唇区突触复合体数量最大，在29℃、32℃、33.5℃、36℃、37℃均变少，在29℃最少(Grohetal.，2004)。在32℃、33℃恒温培养的蜜蜂工蜂封盖子，羽化后它们的1 h短期记忆学习能力明显变差，发育温度越低，短期学习能力越差(Jonesetal., 2005)。

低温影响昆虫的生长发育、生殖以及寿命，极端低温能直接杀死昆虫(安志芳等，2011；陈丽芳等，2015；蒋丰泽等，2015)，低温处理时间越长，影响越大(向玉勇等，2014；李浩等，2015)。为研究低温胁迫对蜜蜂卵的影响，本文研究了0-66 h卵龄的意蜂受精卵在低温20℃下处理不同时间对其孵化率和发育历期的影响，并分析不同发育阶段的意蜂受精卵对低温的敏感性。本研究为了解蜜蜂个体发育和温度生态因子之间的关系奠定了基础，同时也为养蜂实践中评估蜜蜂卵受低温影响程度和制定蜜蜂饲养管理技术措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择群势在7足框以上，蜂王产卵力强的意大利蜜蜂(意蜂)实验蜂群进行受精卵的取样。用扣脾诱王笼将蜂王限制在清理过的工蜂空巢脾表面，促使蜂王在工蜂巢房中产受精卵。限王1 h取样，保证样本为1 h内产下的卵。将产在巢房中的受精卵放入恒温恒湿箱内培养。

1.2 恒温恒湿箱温湿度的控制

用温湿度电子记录仪(HC-02，浙江杭州医用器械有限公司)每隔5 min自动记录1次恒温恒湿箱(CTHI-250B，BSC-250，上海博讯实业有限公司)的温湿度，箱内放入精密水银温度计，每隔1 h人工记录1次温度和相对湿度。监控过程中，若发现温湿度出现异常波动，及时排查原因，随时调整设置，保证恒温恒湿箱温度稳定在±0.2℃，相对湿度稳定在±5%。

1.3 实验设计

将处理组样本放置在最适温湿度(35℃±0.2℃、RH75%±5%)条件下分别培养到0、3、6、9、12、24、36、48、60、66 h卵龄后，在20℃±0.2℃、RH75%±5%条件下处理4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0、28.0、32.0、36.0 h，并对0、3、6、9 h卵龄的卵处理0.5、1.0、2.0 h，再放回最适温湿度条件下培养至孵化。当处理到孵化率为0时就不再进行更长时间处理。对照组的样本在蜜蜂卵发育的最适温湿度条件下培养至孵化。接近孵化每隔1 h观察一次样本孵化情况。

处理组与对照组的样本量均为20粒/群，取3群，每个处理样本量为60粒。

1.4 数据统计分析

用Tukey氏HSD检验法进行反正弦转化后的孵化率和发育历期差异性的检验，对于只有两个处理的比较采用t检验法(SPSS 13.0)。对12-66 h卵龄的意蜂受精卵的发育历期和处理时间进行线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 20℃处理对意蜂受精卵孵化率的影响

2.1.1 20℃处理对0-9 h意蜂受精卵孵化率的影响

20℃处理0-9 h意蜂受精卵0.5 h，孵化率不受影响；处理4.0 h，几乎全部死亡；处理8.0 h，全部死亡。

与对照组相比，0、3 h、6 h、9 h卵处理0.5 h，孵化率分别为85.4%、95.0%、90.6%、92.3%，差异不显著(P>0.05)；处理1.0 h，孵化率为64.9%-81.1%，差异显著(P<0.05)；处理2.0 h，孵化率为51.1%-61.4%，差异极显著(P<0.01)；0 h卵处理4.0、8.0、12 h的孵化率分别为11.1%、3.0%和0，均差异显著(P<0.05)；3、6 h卵处理4.0 h以上全部死亡；9 h卵处理4.0 h的孵化率为20.0%，处理8.0 h以上全部死亡(图1)。

图1 20℃处理对0,3 h,6 h,9 h意蜂受精卵孵化率的影响Fig.1 The effect of 20℃ treatment on the hatchability of 0,3 h,6 h,9 h fertilized eggs注：同一处理卵龄组内小写字母不同表示孵化率差异显著(P<0.05)。图2-图4同。Note: The different lower case letters in the same age group showed significant difference at level 0.05. The same for Fig.2-Fig.4.

2.1.2 20℃处理对12 h、24 h意蜂受精卵孵化率的影响

20℃处理对12 h、24 h卵孵化率的影响较大，处理时间小于8.0 h孵化率不受影响，处理时间大于12 h时，孵化率会显著降低。12 h、24 h卵处理4.0 h、8.0 h的孵化率为75.4%-97.2%，与对照组相比差异不显著(P>0.05)；12 h、24 h卵处理12.0 h的孵化率分别为6.0%、3.7%；12 h卵处理16.0 h全部死亡，24 h处理16.0 h、20.0 h的孵化率分别为3.2%、0.0%(图2)。

图2 20℃处理对12 h,24 h意蜂受精卵孵化率的影响Fig.2 The effect of 20℃ treatment on the hatchability of 12 h, 24 h fertilized eggs

2.1.3 20℃处理对36-66 h意蜂受精卵孵化率的影响

20℃处理对36-66 h卵孵化率影响相对较小，耐低温胁迫能力比0-24 h卵的都要强。

卵龄36-66 h的受精卵耐低温能力随着卵龄增大而逐渐增强。36 h受精卵20℃处理4.0-20.0 h，孵化率为80.6%-98.5%与对照组无差异(P>0.05)；处理24.0 h、28.0 h、32.0 h的孵化率为70.0%-74.2%；处理36.0 h的孵化率为65.3%，随着处理时间延长，与对照组相比，孵化率显著下降(P<0.05)(图3)。

低温20℃处理48 h卵4.0 h、8.0 h、12.0 h、16.0 h、20.0 h、24.0 h，孵化率为73.7%-92.1%，与对照组相比，差异不显著(P>0.05)；处理28.0 h、32.0 h、36.0 h的孵化率为61.4%-72.1%，与对照组相比，差异显著(P<0.05)(图3)。

图3 20℃处理对36 h,48 h意蜂受精卵孵化率的影响Fig.3 The effect of 20℃ treatment on the hatchability of 36 h,48 h fertilized eggs

低温20℃处理60 h卵4.0 h、8.0 h、12.0 h、16.0 h、20.0 h、24.0 h、28.0 h，孵化率为85.0%-98.5%，与对照组相比，差异不显著(P>0.05)；处理32.0 h、36.0 h的孵化率分别为55.0%、41.0%，与对照组相比，差异显著(P<0.05)(图4)。

低温20℃处理66 h卵4.0 h、8.0 h、12.0 h、16.0 h、20.0 h、24.0 h，孵化率为73.7%-92.1%，与对照组相比，差异不显著(P>0.05)；处理28.0 h的孵化率为47.6%，与对照组相比，差异显著(P<0.05)(图4)。

图4 20℃处理对60 h,66 h意蜂受精卵孵化率的影响Fig.4 The effect of 20℃ treatment on the hatchability of 60 h,66 h fertilized eggs

2.2 20℃处理对意蜂受精卵发育历期的影响

20℃条件下意蜂受精卵发育历期较对照组均延长，低温处理时间处理时间越长，发育历期的延长的幅度越大。

35℃下受精卵发育历期平均为70.4 h。低温20℃处理0.5-8.0 h,刚产出的0 h意蜂受精卵的发育历期延长了1.8-10.1 h。3 h的卵，处理0.5 h发育历期差异不显著(P>0.05)，处理1.0-2.0 h，发育历期延长2.1-3.5 h，差异显著(P<0.05)。6 h的卵，处理0.5-2.0 h,发育历期延长2.4-3.6 h，差异极显著(P<0.01)。9 h的卵处理1.0-4.0 h，发育历期延长3.5-5.8 h，差异显著(P<0.05)(表1)。

12-66 h的卵处理4.0 h，发育历期延长3.4-5.7 h；处理8.0 h，发育历期延长了7.1-9.8 h；处理12.0 h，发育历期延长12.0-15.3 h；处理16.0 h，延长16.3-18.5 h；处理20.0 h，延长20.2-23.1 h；处理24.0 h延长24.0-28.8 h；处理28.0 h，延长28.8-32.2 h；处理32.0 h，延长27.5-35.1h；处理36.0 h，延长38.8-39.5 h(表2)。

卵龄为0-66 h的卵经过低温20℃处理后平均发育历期(y)与处理时间(x)呈现显著的线性回归关系y=1.0508x+70.932(R2=0.9964)，延长的发育历期约等于低温处理的时间长度(图5)。

图5 低温处理后0-66 h意蜂受精卵平均发育历期与处理时间关系Fig.5 The linear relationship between average development duration after cold treatment of 0-66 h age fertilized eggs (Apis mellifera ligustica) and the cold exposure time

3 结论与讨论

环境对胚胎不同发育阶段的影响，是发育生物学的重要内容，但这方面的文献很少，大多数论文将胚胎发育全过程作为一个整体进行与环境关系的研究(柴志强等，2012；何嘉等，2014；向玉勇等，2014；马国兰等，2015)。蜜蜂胚胎发育在相对稳定的温度条件下，因此相对其它变温动物蜜蜂的胚胎发育对温度环境更敏感。本研究发现，温度对蜜蜂胚胎各发育阶段影响程度是不同的，该结果对了解温度对变温动物胚胎发育不同阶段的影响有一定的意义。蜜蜂胚胎发育受低温度影响的程度可分为3个阶段，胚胎早期发育受低温度影响最大，胚胎发育的后期相对更耐低温。蜜蜂胚胎发育9 h内处于卵裂阶段，此发育阶段低温对胚胎发育危害最大。说明蜜蜂胚胎发育的卵裂阶段更需要稳定的温度环境，蜜蜂的卵裂是细胞核数量增加过程。蜜蜂胚胎发育 12-24 h处于胚盘形成阶段，低温对胚盘形成仍敏感，但相对于9 h内的蜜蜂卵裂阶段的胚胎对低温耐受性有了大幅度提高。蜜蜂胚胎发育36-66 h处于胚层分化、器官系统形成阶段( Fleigetal., 1985, 1986;Nelson, 1915)，对低温的耐受性有了进一步提高。蜜蜂卵裂发育阶段对发育温度最敏感的机制还未知，可能的原因是低温影响了未来细胞和组织的分化，因为昆虫胚胎卵裂阶段决定了细胞将来发育的命运(韩贻仁，2012)。

低温20℃处理意蜂受精卵后的发育历期均会延长，处理时间越长，发育历期越长。在低温20℃下蜜蜂受精卵的发育速率会受影响。经过低温处理后胚胎发育历期延长的平均时间与处理时间大致相等(k=1.071)。受精卵正常发育历期为70.4 h，24 h卵经过4.0 h处理后的发育历期为74.2 h，60 h卵处理12.0 h后的发育历期为82.4 h。对于蜜蜂胚胎受低温胁迫后发育历期延长的现象，推测有两种原因：一种可能是当蜜蜂胚胎暴露于低温20℃条件下完全停止发育，当卵恢复到温度35℃后又继续正常发育，低温暴露的时间约等于延长的发育历期；另一种可能是蜜蜂胚胎暴露于低温20℃中一段时间时，受影响后的胚胎发育速率开始减慢，即使恢复到最适温度35℃，发育速率仍慢于正常速率，最终胚胎发育历期延长的时间约等于低温暴露时间。

蜜蜂受精卵不同发育阶段暴露于低温条件下有一定的安全期，超过这个安全期会严重影响胚胎的存活。低温敏感期(0-9 h)在20℃安全期小于0.5 h；低温较敏感期(12-24 h)在20℃安全期小于8 h；低温耐受期(>36 h)在20℃安全期小于24 h。在安全期内，低温对卵发育的影响很小或没影响。因此，在实际的蜂群饲养管理中，应注意做好子脾的保温工作，控制子脾暴露在低温环境中的时间和巢内保温条件。例如，在移虫产浆或移虫育王时，含蜜蜂卵的子脾暴露在低温中的时间要控制在较短时间内或者在35℃室温下操作。如果应用卵输送的形式推广良种(马德风等，1974)，建议运送36 h以上的受精卵。

综上所述，在新医改形势下，对公立医院的经济发展造成很大的影响，公立医院作为医疗行业的特殊企业类型，其想要长期稳定的发展，就需要全面了解新医改形势对其具有的机遇与挑战，进而采取有效的措施来推进经济发展。

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Effects of low temperature stress on hatching rate and developmental duration of fertilized eggs of Italian honeybees (Apismelliferaligustica)

CHEN Lin, XU Xin-Jian, ZHU Xiang-Jie, ZHOU Shu-Jing, WANG Qing, HAO Zhen-Bang, ZHOU Bing-Feng*

(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002，China)

Honeybee is a typical model as well as the keynote economic insect. Temperature is crucial to embryonic development of the Italian honeybeesApismelliferaligustica. In the present paper we studied on low temperature effects at 20℃ for different time on the 0-66 h fertilized egg. The results showed that the hatchability decreased and the development durations were prolonged in stressed fertilized eggs. Fertilized eggs of 0-9 h were most susceptible to cold temperature, followed by eggs of 12-24 h and >36 h, suggesting that the late stage of embryos had a less susceptibility to cold temperatures. The average prolonged development duration was positively linearly correlated to the stress time under low temperature. Our data suggested that strategies should be taken to prevent brood rearing hives from cold exposure during early spring management.

Apismelliferaligustica; fertilized eggs; temperature; hatching rate; developmental duration

现代农业蜂产业技术体系建设专项资金(CARS-45-KXJ11)

陈琳，女，1990年生，福建长乐人，在读硕士研究生，研究方向为蜜蜂生态方向，E-mail：fay321@126.com

*通讯作者Author for correspondence，E-mail：bingfengfz@126.com

Received：2016-05-05；接受日期Accepted：2016-06-08

Q963; S893.3

A

1674-0858(2017)01-0111-07

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