血液和无菌体液分离金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感性及毒力基因检测

郭 燕， 吴 湜， 傅祝英杰， 杨 洋， 胡付品， 朱德妹

·论著·

血液和无菌体液分离金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感性及毒力基因检测

郭 燕， 吴 湜， 傅祝英杰， 杨 洋， 胡付品， 朱德妹

目的了解1999－2014年复旦大学附属华山医院血液和脑脊液等无菌体液中分离的金黄色葡萄球菌（金葡菌）对临床常用抗菌药物的敏感性及其毒力基因检测。方法采用琼脂稀释法测定万古霉素等抗菌药物对临床分离金葡菌的最低抑菌浓度（MIC）；采用聚合酶链反应（PCR）法检测MRSA的耐药基因mecA、mecC及其毒力基因PVL和sasX。结果258株金葡菌中MRSA菌株占54.3 %（140 / 258），MSSA占45.7 %（118 / 258），血液、脑脊液和胸腹水等无菌体液中MRSA的检出率由1999－2002年的71.9 %逐年下降至2011－2014年的43.7 %。药敏试验结果显示：MRSA对多数受试抗菌药物的耐药率均高于MSSA。MSSA对受试抗菌药仍然十分敏感，细菌耐药率除青霉素外，均≤11 %。β内酰胺类（除青霉素外）对MSSA的MIC90值均≤1 mg / L。未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药株。90株临床分离的MRSA mecA基因阳性检出率为100 %，未检测到mecC基因； sasX基因的阳性检出率为46.7 %，未检测到PVL基因。sasX阳性的MRSA和sasX阴性的MRSA菌株对β内酰胺类抗生素、磷霉素和左氧氟沙星均高度耐药，但sasX阳性MRSA菌株对阿米卡星和甲氧苄啶-磺胺甲 唑的耐药率均高于sasX阴性的MRSA菌株。结论MRSA对临床多数抗菌药物耐药，为临床合理应用抗菌药物，应重视和加强对金葡菌中MRSA的监测。

金黄色葡萄球菌； 无菌体液； 抗菌药物敏感性

金黄色葡萄球菌（金葡菌）能产生多种毒素、酶和抗原蛋白，具有较强的致病力[1]，是引起感染性疾病的重要病原菌之一。其中甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）对所有的β内酰胺类抗生素耐药，并对大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等大多耐药[1]。甲氧西林耐药是由mecA基因介导的，此基因编码青霉素结合蛋白（PBP）2a。凡在金葡菌中检测到mecA基因或者其编码的PBP2a即为MRSA菌株[2]。近年来有文献报道苯唑西林耐药、mecA基因阴性的MRSA中检测到mecC基因，为介导甲氧西林耐药的另外一种机制[3]。2012年Li等[4]发现在金葡菌中存在一种细胞壁锚定蛋白受控于sasX（Staphylococcus aureus surface protein X）编码基因。此sasX基因主要存在于医院环境内致病性金葡菌中。为了解复旦大学附属华山医院临床分离的金葡菌对多种抗菌药物的敏感性和金葡菌相关的毒力基因，我们收集了本院1999－2014年分离培养的258株金葡菌，采用琼脂稀释法进行抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的测定，同时采用聚合酶链反应（PCR）方法对金葡菌携带的相关耐药基因等进行分子生物学检测，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

1.1.1.1 临床菌株 收集1999－2014年本院临床分离的258株金葡菌（剔除同一患者相同部位重复菌株）进行药物敏感性试验。受试金葡菌主要分离自血液（77.1 %）、脑脊液（7.8 %）、胸腹水（7.4 %）等无菌体液标本。

1.1.1.2 标准菌株 金葡菌ATCC 29213为本院抗生素研究所菌种库保存菌株。

1.1.2 抗菌药物 包括万古霉素、替考拉宁、去甲万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄西林、舒巴坦、头孢唑林、阿米卡星、庆大霉素、利福平、左氧氟沙星、磺胺甲唑、甲氧苄啶、磷霉素等标准品购自中国食品药品检定研究院技术服务部，利奈唑胺为英国Sequoia Research Products公司产品。

1.1.3 主要试剂 哥伦比亚血平皿和药敏试验用Mueller-Hinton琼脂均为英国OXOID公司产品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR试剂为日本TaKaRa公司产品。

1.1.4 PCR引物 根据相应文献合成PCR引物，见表1[5-8]。

1.2 方法

1.2.1 抗菌药物MIC测定 按2012年CLSI M07-A9[9]推荐的琼脂稀释法进行。磷霉素受试浓度为0.125～256 mg / L，甲氧苄啶-磺胺甲唑（1∶19）受试浓度分别为0.004 / 0.076～8 / 152 mg / L，氨苄西林-舒巴坦（2∶1）受试浓度为0.06 / 0.03～128 / 64 mg / L，其他抗菌药物受试浓度分别为0.06～128 mg / L，细菌的接种菌量为104cfu / 点，设置无抗菌药物对照生长平皿。35 ℃ 18～24 h培养后，肉眼观察细菌生长，读取结果。要求无抗菌药物对照生长平皿上受试菌生长良好，受试药对质控菌株的MIC值处在质控要求范围。MIC值定义为未见细菌生长的最低药物浓度即为抗菌药物对细菌的MIC值。

表1 PCR引物序列和扩增片段Table 1 Primers and the amplication conditions of PCR used in this study

1.2.2 结果判断 按照2014年版CLSI[10]的标准判断药敏结果。苯唑西林的MIC值≥4 mg / L者即判断为MRSA；去甲万古霉素、氨苄西林-舒巴坦、头孢唑林和磷霉素2014年版CLSI中没有判断标准，故仅作描述，不作结果判断。

1.2.3 统计分析 运用WHONET 5.6软件进行药敏数据统计分析。

1.2.4 MRSA的DNA模板制备 按文献[11]描述挑取1～2个纯分的新鲜MRSA菌落，置于含200 μL TE缓冲液（pH8.0）的5 mL eppendorf管中；混匀，加入溶葡萄球菌素（20 U / mL）10 μL，37 ℃水浴放置30 min以上；然后于干热器100℃加热20 min，-40℃冰箱中快速冷却10 min；再进行12 000 r / min，5 min离心；所得上清液即为金葡菌DNA模板。

1.2.5 PCR扩增反应条件 预变性94℃，5 min；循环条件：94℃，30 s 、51℃（mecA） / 50℃（mecC）/ 53℃（PVL） / 51℃（sasX），30 s、72℃，50 s ，循环35次；延伸72℃，5 min；保存4℃。

2 结果

2.1 MRSA的检出率

2.1.1 苯唑西林耐药株的检测 258株金葡菌经苯唑西林琼脂稀释法检测，其中对苯唑西林耐药者（MICOXA≥4 mg / L）140株，为MRSA株，占54.3 %（140 / 258）；另118株为MSSA。历年血液、脑脊液等无菌体液中金葡菌对苯唑西林耐药株检出率见表2。血液标本中苯唑西林耐药株占48.2 %（40.0%～63.2%），在脑脊液中占65.0 %，在胸腹水等其他无菌体液中占79.5 %（50.0%～93.8%）。

[n/n （%）]

表2 历年苯唑西林耐药株检出率Table 2 Prevalence of the staphylococcal strains reistant to oxacillin in different 3-year periods

2.1.2 mecA和mecC基因的PCR检测 采用mecA和mecC基因的PCR引物分别对90株临床分离的MRSA株进行PCR扩增，琼脂糖电泳显示90株MRSA均未检测到mecC基因；90株MRSA 100 %显示具有mecA基因的PCR扩增阳性条带，见图1。

2.2 MRSA中杀白细胞毒素（PVL）和sasX基因的PCR检测

运用PVL和sasX基因的PCR引物分别对90株临床分离的MRSA株进行PCR扩增，琼脂糖电泳显示90株MRSA均未检测到PVL基因的PCR扩增产物；42株MRSA具有sasX基因的PCR扩增阳性条带，见图2，检出阳性率占

46.7 %（42 / 90）。

图1 MRSA临床株mecA基因PCR扩增图Figure 1 PCR amplifcation of mecA gene in clinical MRSA strains

2.3 抗菌药物对金葡菌的MIC

2.3.1 MRSA和MSSA MRSA对多种受试抗菌药物的耐药率均高于MSSA，见表3。其不但对受试的β内酰胺类高度耐药，而且对受试的非β内酰胺类如庆大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星等抗菌药物也呈现耐药，耐药率可达48 %或以上；但仍有75 %以上的MRSA对利福平和甲氧苄啶-磺胺甲唑敏感。MSSA对受试的β内酰胺类高度敏感，除青霉素外，苯唑西林、氨苄西林-舒巴坦和头孢唑林对MSSA的MIC50和MIC90均≤1 mg / L。MSSA对受试的非β内酰胺类亦十分敏感，耐药率均≤11 %。磷霉素对MRSA的MIC50和MIC90均＞256 mg / L，但对MSSA的MIC50和MIC90分别为2 mg / L和16 mg / L。在MRSA和MSSA中均未发现对万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药株。

图2 MRSA临床株sasX基因PCR扩增图Figure 2 PCR amplifcation of sasX gene in clinical MRSA strains

2.3.2 sas X基因阳性和阴性MRSA sasX基因阳性和阴性的MRSA对β内酰胺类抗生素、磷霉素和左氧氟沙星均高度耐药，但两类MRSA对庆大霉素、阿米卡星、利福平和甲氧苄啶-磺胺甲唑显示不一样的耐药率，见表4。其中sasX阳性MRSA对阿米卡星和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率均显著高于sasX阴性株（100 %对27.1 %；64.3 %对6.2 %；P＜0.01），对庆大霉素的耐药率略高于sasX阴性MRSA（100 %对87.5 %；P ＜0.05）；但对利福平的耐药率：sasX阳性MRSA略低于sasX阴性MRSA（0 对16.7 %；P ＜0.05）。

表3 抗菌药物对金葡菌的体外抗菌活性Table 3 In vitro activities of antimicrobial agents against Staphylococcus aureus strains

表4 抗菌药物对sasX阳性和sasX阴性MRSA的体外抗菌活性Table 4 In vitro activities of antimicrobial agents against sasX-positive and sasX-negative MRSA strains

3 讨论

金葡菌可引起皮肤软组织、骨感染和肺炎等感染性疾病，也是引起医疗机构相关血流感染的重要病原菌之一[11]。甲氧西林用于临床后不久， 1961年即出现首株MRSA[12]。50余年以来，MRSA在世界范围内流行，造成耐药问题日益严重，引起广泛关注。2013年CHINET细菌耐药性监测网[13]的报道中金葡菌的检出率为9.61 % ，占全年分离细菌的第5位；其在革兰阳性菌中居首位。其中MRSA的检出率占金葡菌的45.2 %。

本组资料显示血液、脑脊液和胸腹水等无菌体液中的MRSA总检出率为54.3 %。如以4年为一时间段，相比较每个时间段的MRSA检出率，1999－2002年和2003－2006年分别为70 %和71.9 %， 至2007－2010年 和2011－2014年，MRSA的检出率分别为51.3 %和43.7 %，显示血液、脑脊液和胸腹水等无菌体液中MRSA的检出率在逐年下降。这与国内外有关MRSA检出率显示有逐年下降的趋势相一致[14-18]。如2012年欧洲报道MRSA的检出率由2002年的40 %～45 %下降至2010年的15 %～20 %[14]。CHINET 2016年报道[15]在2005－2014年的10年监测中MRSA检出率从2005年的69 %下降至2014年的42.5 %；血液标本中MRSA的检出率也从2010年的51.1 % 下降至2011的42.5 %[16-17]；脑脊液标本中MRSA的检出率也由2005年金葡菌中的82.1 %逐年下降到2007年的72.0 %[18]。上述标本中分离检出的MRSA对临床常用的β内酰胺类和非β内酰胺类抗菌药物均非常耐药，但对甲氧苄啶-磺胺甲唑和磷霉素的耐药率较低。除青霉素外，MSSA对β内酰胺类抗生素仍很敏感，MIC90值均≤1 mg / L。本组资料未发现对万古霉素（包括去甲万古霉素）、替考拉宁和利奈唑胺耐药的菌株。这与CHINET细菌耐药性监测资料一致[13，15-18]。

金葡菌可产生一种特殊的PBP 2a，由mecA基因编码，经转座子携带并整合至葡萄球菌染色体的mec部位[19]。故凡在金葡菌中检测到mecA基因者，即为MRSA株。本组资料中受试检测的90株MRSA均携带有mecA基因。

2011年英国Garcia-Alvarez等[3]报道在2007年的英国奶牛乳腺炎调查中发现，在一些对苯唑西林和头孢西丁均耐药的MRSA菌株中mecA基因和PBP2a均为阴性 。PCR测定在这些MRSA中可检测到与mecA基因的同源性高达70 %的耐药基因，被命名为mecALGA251基因 。该研究团队同时对库存金葡菌进行了mecALGA251基因筛选。在1株1975年分离自患者的金葡菌中也发现具有相同的基因型。由此表明mecALGA251基因存在于金葡菌中已有近40年的时间，并且很可能来源于人类菌株。2012年国际葡萄球菌SCC盒式染色体分型工作组建议[20]将mecALGA251基因命名为mecC基因。本组资料显示受试检测的90株MRSA中未发现mecC基因。由于mecC基因阳性的MRSA目前仅在欧洲报道，推测此基因的检出存在地域差异；亦有可能是PCR的引物或者扩增条件不够完善，需继续改进检测方法。如果微生物实验室检测到苯唑西林或头孢西丁耐药的MRSA，而PCR测定其mecA基因为阴性时，需考虑mecC基因存在的可能。

PVL是金葡菌产生的一种细胞外毒素，由LukS-PV（S组份）和LukF-PV（F组份）两个基因编码共同转录[21]。PVL可损伤细胞膜，使细胞溶解，引起感染进一步扩散。余方友等[22]报道温州地区来自不同标本分离的MRSA中，PVL检出率为15.7 %（19 / 121）。本组资料中90株分离自血液、脑脊液等无菌体液标本的MRSA中未检测到PVL阳性株。而余方友等[22]检出具有PVL基因的菌株大多分离自脓液或创面分泌物和痰液标本，推测金葡菌中PVL的检出可能与标本来源有关，同时可能有地域和医疗机构的分布差异。

sasX基因于2012年首次发现于金葡菌中[4]，为一种细胞壁锚定蛋白编码基因。sasX基因主要存在于医院环境内致病性的金葡菌中，这些临床分离的金葡菌可能通过获得sasX基因更加适应医院环境，造成医院内持续感染；而在正常人鼻腔中定植的金葡菌中sasX基因的阳性率仅为0.59 %。本组资料显示90株临床分离的MRSA中，sasX基因阳性的MRSA高达46.7 %，并对多种非β内酰胺类抗菌药物的耐药率均高于sasX基因阴性的MRSA，此与杜昕等[23]报道是一致的。

甲氧西林耐药葡萄球菌仍然是目前临床上的严重问题[1]。2015年美国CDC曾报道2002－2015年底已发现万古霉素耐药金葡菌（VRSA）14株[24]、万古霉素中介金葡菌（VISA）和异质性万古霉素中介金葡菌（hVISA）均已在世界各地报道[1]，这些万古霉素耐药的菌株为革兰阳性菌中的广泛耐药（XDR）菌株[25]。有效治疗药物除利奈唑胺、头孢洛林（国内还未上市）外，临床上并不多。本组资料虽未发现VRSA以及VISA等菌株，但仍需重视对我国金葡菌中MRSA的监测，密切关注VRSA 、hVISA 和VISA等菌株的出现，更需重视血液、脑脊液和胸腹水等无菌部位标本中的MRSA检出。

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In vitro antimicrobial susceptibility and virulence genes of the Staphylococcus aureus strains isolated from blood and sterile body fuids

GUO Yan, WU Shi, FU Zhuyingjie, YANG Yang, HU Fupin, ZHU Demei. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

ObjectiveTo investigate the antimicrobial susceptibility and associated virulence genes of the Staphylococcus aureus strains isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids in Huashan Hospital from year 1999 to 2014.MethodsMIC values of vancomycin and other antibiotics against S. aureus were measured by agar dilution method. Resistant genes mecA and mecC and virulence genes PVL and sasX were detected by PCR in the S. aureus strains.ResultsThe overall prevalence of MRSA in S. aureus was 54.3 % (140 / 258) and 45.7 % (118 / 258) for MSSA. Resistance rates of MRSA to most antimicrobial agents were higher than MSSA. MSSA strains were still sensitive to all the antibiotics tested, resistance rate not higher than 11 % except penicillin. MIC90values of β-lactam antibiotics (except penicillin) to MSSA were lower than 1 mg / L. No staphylococcal strains were found resistant to vancomycin, teicoplanin or linezolid. The mecA gene was present in all the 90 MRSA strains, and sasX gene in 46.7 % of the strains. The prevalence of MRSA isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids decreased year by year. No mecC gene or PVL gene was identifed in these MRSA strains. Both sasX-positive MRSA and sasX-negative MRSA were resistant to β-lactam antibiotics, fosfomycin and levofoxacin. The sasX-positive MRSA strains showed higher resistance rates to amikacin and trimethoprim-sulfamethoxazole than sasX-negative MRSA.ConclusionsThe MRSA strains isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids in Huashan Hospital were resistant to most commonly used anbiotics. MRSA surveillance is critical for rational use of antimicrobial agents.

Staphylococcus aureus; sterile body fuid; antimicrobial susceptibility

R378.11

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0127-07

10.16718/j.1009-7708.2017.02.002

2016-06-03

2016-08-05

国家科技部“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09303004-001）。

复旦大学附属华山医院抗生素研究所，卫生部抗生素临床药理重点实验室，上海 200040。

郭燕（1982—），女，硕士，主管技师，主要从事新抗菌药物药效学和细菌耐药性研究。

朱德妹，E- mail：zhu_dm@fudan.edu.cn。