多重耐药革兰阴性菌对多黏菌素的耐药机制

陈浩俊， 李从荣

·综述·

多重耐药革兰阴性菌对多黏菌素的耐药机制

陈浩俊， 李从荣

革兰阴性菌； 多黏菌素； 耐药机制

细菌对抗生素耐药是21世纪威胁人类生命健康的最大难题之一。由于抗生素的滥用，导致出现大量多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）和全耐药（PDR）的细菌，特别是产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌、不动杆菌属和假单胞菌属等革兰阴性细菌[1]。治疗这些“超级细菌”所致的感染，目前可用的有效抗菌药物有限，替加环素和多黏菌素类抗生素是治疗MDR菌最后选择。然而随着多黏菌素的广泛使用，相应的耐药菌流行导致临床治疗无效。

多黏菌素属于阳离子抑菌肽，于1947年被发现。多黏菌素家族有5类，其中多黏菌素B和多黏菌素E是临床最常用的2种抗生素。由于肾毒性比较明显，于20世纪80年代临床已停止使用。然而随着出现MDR革兰阴性菌无药可治的局面，多黏菌素作为一种“老药”又重新被用于临床抗感染治疗[2]。目前已知的多黏菌素耐药机制主要是由于革兰阴性菌脂多糖上的脂质A的结构改变，包括脂质A的修饰或缺失，另外荚膜多糖、外排泵系统以及最近发现的耐药基因mcr-1也可能参与其耐药。本文就革兰阴性菌对多黏菌素的耐药机制新进展进行综述并归纳总结于表1[3-17]。

1 脂质A修饰或缺失介导多黏菌素耐药

1.1 氨基阿拉伯糖修饰

当受到多黏菌素的攻击时，细菌通过带正电荷的氨基阿拉伯糖添加到脂质A上降低其电负性，从而导致细菌与带正电荷的多黏菌素的亲和力下降达到保护作用。早在1998年，Gunn等[3]就首次提出这一假设。他们认为多黏菌素耐药是因为鼠伤寒沙门菌染色体上存在一种调节单元pmrAB，pmrAB的产物可组装氨基阿拉伯糖到脂质A上，从而改变脂多糖结构导致多黏菌素耐药。然而困于当时的局限性，他们并未阐明参与pmrAB调节的中间产物是什么，仅仅推测出pmrAB的两个调节位点pmrE和pmrF。

随 后 Trent等[18]和 Breazeale等[19-21]团 队发现pmrAB转录因子调控着五基因pmrHFIJK（arnBCADT）的表达，所编码的酶与氨基阿拉伯糖的合成和转运密切相关。Yan等[4]又发现了2个操纵子基因可能与氨基阿拉伯糖修饰相关。他们通过使用卡那霉素耐药盒替换法（kanamycin resistance cassettes）得到敲除pmrL（arnF）和pmrM（arnE）基因的变异菌株，体外药敏结果显示，敲除arnEF基因后的耐药菌株对多黏菌素敏感性得以恢复。最后通过电喷雾质谱和薄层色谱法对脂质A结构进行分析，发现敲除arnEF基因的耐药株普遍缺少氨基阿拉伯糖结构。这一强有力的证据证实七基因arnBCADTFE参与脂质A上的氨基阿拉伯糖合成和转运。

表1 革兰阴性细菌对多黏菌素的耐药机制

除了pmrCAB基因外，二元调节系统phoPQ、调控基因mgrB也能介导肺炎克雷伯菌对氨基阿拉伯糖的结构修饰[22-23]。可见氨基阿拉伯糖结构的改变并非单一因素影响。

1.2 磷酸乙醇胺修饰

PmrCAB除了参与氨基阿拉伯糖的结构修饰外，同时也与磷酸乙醇胺的修饰有关。为了阐明pmrCAB在耐多黏菌素鲍曼不动杆菌中的调控作用，Beceiro等[5]通过对敏感株、耐药株以及体外诱导耐药突变株pmrB测序，接着构建敲除pmrB基因后的突变株并检测多黏菌素的敏感性，最后利用反转录PCR（RT-PCR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术得到上述4类菌株的pmrCAB基因表达量以及脂质A的结构。结果显示，相较于耐药菌株，pmrB缺失的突变株恢复了敏感性，同时耐药菌株普遍存在pmrB基因突变位点，pmrAB表达上调，而pmrC的表达使得磷酸乙醇胺被组装到脂质A上，最终导致脂多糖结构改变。

类似的实验结果在肺炎克雷伯菌中也得到证实。Jayol等[6]发现耐多黏菌素突变株在PmrB蛋白上发生氨基酸替换，pmrCAB基因表达试验显示，相较于敏感株，耐药株至少有高达70倍的过表达。

1.3 脂质A合成障碍

鲍曼不动杆菌对多黏菌素耐药机制主要有2个。一是上述提到的pmrCAB介导的磷酸乙醇胺结构修饰；二是合成脂质A所需的3个基因lpxA、lpxC、lpxD发生突变或缺失[7]。由于脂质A合成障碍，导致多黏菌素作用靶点缺失，即含有这些基因突变菌株的多黏菌素最低抑菌浓度将会上升。进一步的研究表明，除常见的lpxA、lpxC、lpxD可致脂质A合成障碍外，一种新型的lpsB基因突变也能导致多黏菌素耐药[24]。此外，由于合成脂质A需要复杂的酰基化、磷酸化、糖基化过程，任何影响这一过程的基因突变都会导致多黏菌素耐药。

为了阐释到底是鲍曼不动杆菌的lpx基因突变付出的生物学代价大，还是pmrB基因突变代价大。Beceiro等[25]做了一个关于多黏菌素耐药机制对鲍曼不动杆菌毒力影响的研究。通过分析lpx和pmr突变株的生长率和毒力得出，在细菌适应和致病能力方面，相较于磷酸乙醇胺修饰耐药，脂多糖缺失会使鲍曼不动杆菌付出的代价更大，即磷酸乙醇胺修饰的耐药机制可通过较小的代价使鲍曼不动杆菌获得更大的危险因素。

2 荚膜多糖介导多黏菌素耐药

多黏菌素通常作用于细菌外膜上的脂多糖，通过破坏其结构致细菌裂解死亡。为了应对这样的杀菌机制，细菌会降低外膜上的阴离子电荷从而降低其与多黏菌素间的亲和力。然而Campos等[8]发现肺炎克雷伯菌并非通过这一机制耐药，相反，荚膜多糖才是肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药的重要因素，荚膜多糖通过阻止多黏菌素与细菌表面结合，从而保护脂多糖不受其破坏。

三是积极培育内部人才市场，完善人才内部流动机制。逐步建立分区域、分板块，有形和无形市场相结合的人才市场体系，不断完善市场功能，扩大信息量，增加覆盖面，进一步疏通三支队伍之间、板块之间、企业之间的人才流动渠道，促进人才系统内部合理流动，减少人才流失。

Campos等[8]利用临床肺炎克雷伯菌52145（血清型 01∶K2）的同源突变体菌株52K10（不表达荚膜多糖）和52021（不表达O抗原），评价荚膜多糖在多黏菌素中的耐药作用。结果表明在同一多黏菌素浓度下，有荚膜多糖的菌株52021比无荚膜多糖的菌株52K10相对存活数多（P＜0.05），即荚膜多糖使肺炎克雷伯菌具备一定抵抗多黏菌素的能力，而且研究发现荚膜多糖表达越多，这样的趋势越明显。

同时，Llobet等[9]也验证了荚膜多糖对多黏菌素具有抵抗作用。而且荚膜多糖的保护机制也将激活病原微生物的其他保护措施，包括细菌表面电荷的改变等。

3 外排泵系统介导多黏菌素耐药

少数研究报道外排泵也能导致多黏菌素耐药。最近，Padilla等[10]注意到外排泵系统也可能与多黏菌素耐药相关。他们发现含有acrAB的临床肺炎克雷伯菌52145R经过多黏菌素孵育过后，仍然有将近90%的存活率，这直接地证明了拥有acrAB外排泵的肺炎克雷伯菌可能对多黏菌素耐药。而在另一个实验中，Srinivasan等[11]发现，相较于耐多黏菌素的野生型菌株，敲除kpnEF外排泵基因后的突变株增大了多黏菌素敏感性，同时突变株会破坏荚膜多糖结构。

4 质粒介导多黏菌素耐药

细菌大多通过染色体基因突变、缺失、插入的方式导致多黏菌素耐药，尚无关于质粒介导多黏菌素耐药机制的报道。最近，Liu等[12]在中国首次报道质粒介导mcr-1基因致人源性和动物源性的肠杆菌科细菌对多黏菌素耐药，随后全球其他国家相继报道在肠杆菌科细菌中检出mcr-1基因，包括美国、拉丁美洲、意大利、英国等西方欧美国家[13-14，26-27]。携带mcr-1基因“超级细菌”的全球流行，敲响了产超广谱β内酰胺酶或产碳青霉烯酶同时耐多黏菌素的肠杆菌科细菌的警钟。

在Liu等[12]的耐药机制研究中，分别通过全基因组测序和同源建模进行mcr-1基因序列和蛋白结构分析。Mcr-1蛋白属于磷酸乙醇胺转移酶家族中的一员，mcr-1基因表达可将磷酸乙醇胺组装到脂质A上，修饰后的脂质A与多黏菌素亲和力下降致其耐药。质粒转移接合试验显示，携带mcr-1接合子多黏菌素敏感性明显下降，同时菌株间质粒转移（plasmid transfer）频率在1‰～1%，这意味着mcr-1介导多黏菌素耐药在菌株间的播散能力相当强。测序结果表明，1 626 bp的mcr-1基因的表达受上游插入序列ISApl1控制。同时mcr-1分子流行病学调查显示，医院感染的大肠埃希菌中的检出率仅为1%，尽管检出率不高，但mcr-1高效播散能力使我们不能忽视这一耐药机制。

在mcr-1介导质粒耐药机制报道后，Du等[28]对其所在医院2013年至2015年期间收集的17株多黏菌素耐药的肠杆菌科细菌进行回顾性分析，结果检出4株mcr-1阳性菌株（1株ST2248大肠埃希菌， 2株ST25肺炎克雷伯菌，1株ST2085大肠埃希菌）。测序结果显示，ST2248和ST25的mcr-1位于pMCR1-IncX4质粒上，而ST2085的mcr-1位于pMCR1-IncI2质粒上[29]。尽管大多数研究报道mcr-1存在于质粒上，然而他们提出假设在产碳青霉烯酶的大肠埃希菌中染色体上也存在mcr-1基因[15]。这一假设尚存在争议，需要更多的证据来评价它的真实性。

5 总结与展望

随着MDR菌在全球医院感染中肆虐，目前有效的治疗药物有限，多黏菌素已重新被用于治疗“超级细菌”感染。本综述通过分析国内外革兰阴性细菌对多黏菌素耐药的机制发现，革兰阴性菌对多黏菌素耐药的机制主要集中在脂多糖或脂质A的结构修饰或缺失。

无论多黏菌素的作用靶点是结构改变还是缺失，以往这一耐药机制是基于细菌染色体提出的，而最新的质粒介导mcr-1致肠杆菌科细菌对多黏菌素耐药的机制研究打破了人们对这一理论机制的束缚，从全新的质粒视角给予更为深层次的剖析。毕竟基于染色体的耐药遗传属于单克隆同源播散，而基于质粒的耐药传播可在细菌与细菌之间流行。

总之，随着多黏菌素耐药机制的深入研究，将有助于避免耐药菌株的播散，同时为新型抗生素的研发提供一定的理论基础。

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Mechanisms of polymyxin resistance in multidrug-resistant Gram-negative bacteria

CHEN Haojun, LI Congrong. （Department of Laboratory Medicine, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China）

R978.5

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0229-04

10.16718/j.1009-7708.2017.02.023

2016-07-05

2016-08-13

国家临床重点专科建设项目（财社［2010］305）。

武汉大学人民医院检验科，武汉 430060。

作者介绍： 陈浩俊（1990—），男，硕士研究生，主要从事临床病原微生物耐药机制及检测方法研究。

李从荣，E-mail: congrongLi33@hotmail.com。