禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

王艳萍，董林，郭时金，2，徐倩倩，莫玲，王金良，刘吉山，沈志强，2

(1．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600;2．山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600; 3．山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州256600)

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

王艳萍1，2，3，董林1，郭时金1，2，徐倩倩1，2，3，莫玲1，王金良1，刘吉山1，沈志强1，2

(1．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600;2．山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600; 3．山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州256600)

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(Highpathogenicity island HPI)流行情况和基因特征，根据GenBank已知禽源irp2基因序列，设计、合成一对特异性引物，建立irp2基因PCR检测方法，优化、确定PCR扩增特性，进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示，建立的PCR检测方法敏感性可达2．14×10－4ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测，变异系数3．4%～5．0%。256份临床样品PCR检测irp2基因，阳性率30．6%。获得了9株分离株irp2基因序列，分析显示，与Gen-Bank已知基因同源性高达96．2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。

禽源大肠杆菌;HPI;毒力岛;irp2基因

近年来畜禽大肠杆菌病严重影响着中国养禽业的发展，虽然采取了强有力的防治措施，但由于大肠杆菌的变异性及耐药性日益增强，依然没有找到有效控制大肠杆菌病方法，于是专家们将焦点集中到了针对大肠杆菌的分子生物学研究上，期望通过对微观的研究发现一些解决问题的线索，其中大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)就是目前研究的重点之一。

1 试验材料

1．1 菌株来源试验菌株:265株禽源大肠杆菌，分离自山东、江苏、河南、安徽、河北、辽宁等地;大肠杆菌O2标准株由安徽农业大学动物科技学院基础兽医学教研室馈赠。

1．2 试剂与主要仪器pMD18－T、DL-2 000 DNA Marker、DL-15 000 Marker、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP、蛋白酶K、琼脂糖等，购自宝生物工程(大连)有限公司;营养琼脂，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;LP0021、LP0042，购自OXOID LTD;细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、多功能DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)，均购自北京百泰克生物技术有限公司。

2 试验方法

2．1 引物设计与合成根据GenBank中已发表的禽源大肠杆菌高致病性毒力岛irp2基因序列，选取强保守性区段，设计如下特异性引物，用于irp2特异性序列PCR扩增，理论跨度约为521nt。引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

表1 irp2引物设计

2．2 irp2基因PCR检测方法建立

2．2．1 大肠杆菌O2菌株基因组DNA制备挑取单个菌落，接种LB液体培养基，培养10 h后，10 000r/min离心2 min收集菌体，提取细菌基因组DNA，具体操作按北京百泰克生物技术有限公司细

菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

2．2．2 PCR扩增程序以制备的大肠杆菌O2DNA为模板，以PF－irp2、PR－irp2为引物进行PCR扩增，PCR体系:10×PCR Buffer 2．5 μL，dNTP 2．0 μL，PF－irp2/PR－irp2 1．0 μL，DNA模板4．0 μL，ddH2O 14．0 μL，rTaq 0．5 μL，总体系25．0 μL，确定最佳PCR程序。

2．3 PCR检测方法性能评价

2．3．1 敏感性检测将制备的大肠杆菌O2模板DNA进行10倍比系列稀释，测定各组份核酸含量，以不同稀释度DNA为模板进行irp2基因PCR扩增，检测其敏感性。

2．3．2 特异性检测分别提取鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴士杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)和禽源致病性大肠杆菌基因组DNA(其中新城疫和流感病毒提取RNA反转录成cDNA)。以制备的各类DNA为模板，进行irp2基因检测，评价建立的检测方法特异性。

2．3．3 重复性检测用3株已知irp2阳性禽源致病性大肠杆菌，2株已知irp2阴性禽源大肠杆菌，提取细菌基因组，每一样品进行5次PCR检测，检测建立的检测方法重复性。

2．4 禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因检测应用建立的PCR方法对265例2014－2015年间来自辽宁、山东、江苏、河南、安徽、河北等地临床分离的禽源性大肠杆菌进行irp2毒力岛基因检测。检测病例病理剖检多表现为大肠杆菌病特征性病变，大肠杆菌性败血症表现为纤维素性心包炎，肝脏有白色被膜、有纤维素性附着物，有时有白色坏死性结节，脾脏肿胀、充血;卵黄性腹膜炎及输卵管炎、出血性肠炎，幼雏表现为脐带炎等，个别产蛋鸡症状不明显等等。

2．5 irp2毒力岛基因遗传特性分析回收PCR检测阳性样品DNA，连接pMD18－T，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用Clustalx8．3、MEGA5．10软件进行基因同源性及遗传变异分析。

3 结果

3．1 irp2基因PCR扩增结果确定的PCR条件为:95℃4 min，94℃1 min，55℃40 s，72℃45 s，30个循环，72℃10 min，4℃终止。大肠杆菌O2标准株DNA为模板经PCR扩增后，产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，可看见大约521 bp的特异性目的条带(图l)，与预期结果相符。回收PCR产物，经DNA序列测定分析，与已知的禽类大肠杆菌毒力基因irp2同源性在98．2%以上，说明建立的irp2基因PCR检测方法可特异性扩增目的irp2基因。

3．2 敏感性检测提取大肠杆菌O2DNA经10倍比稀释后取2．14×101ng/μL、2．14×100ng/μL、2．14×10－1ng/μL、2．14×10－2ng/μL、2．14×10－3ng/μL、2．14×10－4ng/μL、2．14×10－5ng/μL浓度DNA为模板进行PCR敏感性检测，结果显示，在2．14×10－4ng/μL浓度以上检测目的条带清晰可见，2．14×10－5ng/μL浓度时检测条带出现模糊(图2)，确定建立的PCR检测方法最高检测敏感性为2．14×10－4ng/μL。

图1 irp2基因PCR扩增结果1～3:肠杆菌O2标准株;4:性对照; M:DNA Markers DL－2000

图2 PCR敏感性检测结果M:DNA Markers DL-2 000;1～8:2．14×102、2．14×1012．14×100、2．14×10－1、2．14×10－2、2．14×10－3、2．14×10－4、2．14×10－5ng/μL;9:阴性对照

3．3 特异性检测特异性检测结果显示，仅以禽致病性大肠杆菌基因组为模板的PCR扩增呈阳性，在约521bp有特异性目的条带，而以鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸为模板，PCR扩增均无特异性条带出现，说明建立的检测方法特异性良好(图3)。

图3 PCR特异性检测结果M:DNA Markers DL-2 000;1:沙门氏菌;2:副鸡嗜血杆菌; 3:鸭疫里默菌:4:禽巴氏杆菌;5:鸡毒支原体;6:鸡新城疫病毒; 7:禽流感病毒(H9N5);8:阴性对照;9:禽致病性大肠杆菌

3．4 重复性检测3份阳性样品、2份阴性样品分别重复5次检测，PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，3份阳性样品检测结果见图4，薄层灰度分析显示，阳性样品变异系数在3．4%～5．0%，阴性样品5次重复均为阴性结果，说明建立的PCR检测方法重复性良好。

图4 重复性试验结果M:DNA Markers DL-2 000;1－5:阳性样品1; 6～10:阳性样品2;11～15:阳性样品3;16:阴性对照

3．5 临床样品检测应用应用建立的PCR方法检测了临床病例，结果irp2阳性数81份，阳性率为30．6%，不同地域、不同宿主来源对毒力岛基因无明显区别。irp2阳性样品PCR产物，电泳检测均出现约521 bp特异性目的条带(图5)，说明建立的检测方法具有良好的临床实用性。

图5 部分临床样品检测结果1－12:阳性样品结果;13:阴性结果;14:阳性对照;15:阴性对照;M:DNA Markers DL-2 000

3．6 同源性分析获得了9株禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因序列，经Clustalx8．3、MEGA5．10软件进行基因同源性，结果显示，其与GenBank中已知基因同源性高达96．2%以上，显示其在遗传进化保守性较强。遗传进化分析，显示不同分离株irp2基因存在差异性，分属不同基因分支，同源性高的毒株间存在相似基因序列特征变异(图6)。

4讨论

随着养殖方式和规模不断变化，细菌性疾病，特别是由大肠杆菌病导致的损失，在禽类养殖中愈显重要，同时，由于抗生素在养殖中滥用致临床大肠杆菌变异性和耐药性日益增强，使得现有防控手段和技术不能有效应对威胁。因此，开展大肠杆菌相关毒力因子研究，从微观分子水平探索其致病机开展大肠杆菌相关毒力因子研究，从微观分子水平探索其致病机理对临床大肠杆菌病的预防和治疗具有一定现实意义。大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)作为重要致病因子，在E．coli致病过程中发挥作用。irp2作为铁调节蛋白，是检测毒力岛的标志基因。

图6 irp2基因遗传进化分析结果irp2－3/4/6/8/9/12/14/20/21标号为自己分离株irp2基因序列;其他标号为GenBank中已知序列

本试验针对毒力岛标志毒力因子irp2在禽致病性大肠杆菌中的基因分布特征和遗传变异进行相关研究。建立了快速、特异、灵敏和可重复的irp2基因PCR检测方法，对265份临床禽源致病性大肠杆菌进行irp2进行检测，阳性率30．6%(81/265)，这与Schubert［11］(27%)结果一致，高于张冬梅［12］(14%)和陈伟［13］(21．6%)，低于许丽［14］的(44%)和王鑫［15］的(47．8%)。这可能与临床样品选取及流行毒株区域差异性有一定相关性。获得了9株禽致病性大肠杆菌HPI irp2基因序列，与GenBank中参考毒株基因同源性高达96．2%以上，显示irp2基因在不同毒株间具有很高的保守性，这与董炳敏(97%)和程伯鲲(95．5%)等报道的同源性结果一致，irp2等毒力岛基因高度保守性可能与其在不同宿主菌株间的水平转移有关，具体原因有待进一步研究。

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Establishment and application of PCR detection method for HPI irp2 gene of avian Escherichia coli

WANG Yan-ping1，2，3，DONG Lin1，GUO Shi-jin1，2，XU Qian-qian1，2，3，MO Ling1，WANG Jin-liang1，LIU Ji-shan，SHEN Zhi-qiang1
(1．BinZhou animal Science and Veterinary Medicine institude，Binzhou 256600，China;2．Shandong Binzhou Research，development and promotion center for Livestock and poultry propolis vaccine，Binzhou 256600，China;3．Shandong lvduante Animal Medicine Co．，Ltd，Binzhou 256600，China)

The purpose of this paper is to establish the PCR detection method of irp2．To understand the clinical poultry pathogenic escherichia coli High pathogenicity island(HPI)prevalence and genetic traits，a pair of specific primers were designed and synthesised according to gene sequence of irp2 and the PCR detection method was established，evaluation about optimization，determining the PCR amplification characteristics，sensitivity，specificityor and repeatability were studied．Irp2 gene was detected and genetic variation was analyed on 256 E．coli strains isolated from clinical avian．Results showed that the sensitivity was 2．14×10－4ng/ μL;Specificity displayed that there was no cross reaction between salmonella，vice chicken haemophilus，Riemerella anatipestifer，poultry pasteurella，Mycoplasma gallisepticum，Newcastle disease virus，and avian influenza virus(H9N5);Repetitive showed that the variation coefficient was 3．4～5．0%if three positive samples repeated 5 times testing．Irp2 gene was detected by PCR from 256 clinical samples，and positive rate was 30．6%．The analysis of 9 strain irp2 gene sequences revealed that the homology was more than 96．2%when compared with Genbank known gene．The method of E．coli HPI irp2 gene PCR detection has a good specificity，sensitivity and repeatability，and it can be applied to clinical gene rapid detection of HPI．

Avian Escherichia coli;HPI pathogenicity island;irp2 gene

SHEN Zhi－qiang

A

0529-6005(2017)01-0086-04

2015－11－26

山东省自然科学基金资助项目(ZR2014CQ012)

王艳萍(1979－)女，助理研究员，硕士，从事中兽药和畜禽细菌性疫病研究，E-mail:xiaowangyanping 213@163．com

沈志强，E-mail:1292986799@qq．com