昆明市区鸡源大肠杆菌毒力基因的流行特征试验

杨 娟 ， 吴海滨 ， 黄 超 ， 谭 珊 ， 吴培福

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224)

昆明市区鸡源大肠杆菌毒力基因的流行特征试验

杨 娟 ， 吴海滨 ， 黄 超 ， 谭 珊 ， 吴培福

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224)

大肠杆菌致病性及其携带毒力基因的种类存在相关性，为此，研究大肠杆菌毒力基因的流行特征对生产实践和食品安全具有指导意义。本研究从昆明市农贸市场随机采集鸡肝，从中分离鉴定大肠杆菌，并对12种毒力基因的流行特征进了研究。结果表明：从鸡肝中共分离鉴定出140株大肠杆菌；feoB毒力基因携带率为100%；fimA和traT毒力基因携带率均为99.29%；papC毒力基因检出率最低为21.43%。91.67%毒力基因检出率在50%以上，33.33%毒力基因在90%以上，同时携带12种毒力基因的概率为3.57%。提示：昆明市各区农贸市场鸡肝中大肠杆菌毒力基因携带率高。

禽源大肠杆菌 ； 毒力基因 ； 流行特征

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠埃希菌引起的一种传染性疾病。禽大肠杆菌的致病性由APEC的多种毒力基因共同决定。当细菌侵入机体并发病时，这些毒力因子相互协调、共同作用。到目前为止，已知的毒力因子有：温度敏感血凝素、粘附素、铁离子获得系统(耶尔森菌强毒力岛、气杆菌素)、Iss蛋白、肠细胞脱落位点毒力岛、毒素、ColV和ColBM质粒等[1]。与毒力因子相关的毒力基因决定了大肠杆菌的致病性[2]。本试验对140株禽源性大肠杆菌分离菌进行irp2、fimA、papC、iss、tsh、fyuA、feoB、iroN、iucC、iutA、cvaC、traT 12种毒力基因的PCR检测，目的在于了解禽源大肠杆菌分离株中毒力基因的携带情况，进一步探明毒力基因与菌株致病性的相关性，为禽源性大肠杆菌致病机理的研究及制定有效的防制措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 鸡肝(2015年5月分别随机采集于昆明市呈贡区、官渡区、盘龙区、西山区、五华区的农贸市场，每区3个农贸市场，每个农贸市场至少采集8个鸡肝，共310个)；LB固体培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基，均购自昆明硕阳科技有限公司。

1.2 大肠杆菌分离与鉴定 本试验对鸡肝中其他种的细菌也进行了分离，故先采用LB固体培养基分离细菌，而后利用麦康凯培养基和伊红美蓝培养基来初步筛选大肠杆菌，最后利用PCR技术和生化试验进一步鉴定大肠杆菌。PCR鉴定(Uid和16S rRNA基因)所用引物参见文献[3-4]。生化试验包括：糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖)、明胶液化试验、硫化氢试验、吲哚(靛基质)试验、甲基红(M.R.)试验、V-P试验、枸橼酸盐利用试验。

1.3 毒力基因的扩增 通过全菌裂解法提取大肠杆菌基因组DNA，并对12种毒力基因的流行情况进行了检测。12种毒力基因包括：feoB、traT、fimA、fyuA、irp2、roN、iucC、tsh、iutA、iss、cvaC和papC。扩增引物及参数参考文献[7]，由铂尚生物技术有限公司合成。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离鉴定 总共分离到504株细菌，最终鉴定出140株大肠杆菌，检出率为27.78%。分离的大肠杆菌在麦康凯培养基上生长为表面光滑、边缘整齐、圆形隆起的红色菌落；在伊红美蓝培养基上为黑色带金属光泽的菌落；革兰染色均为阴性，生化鉴定特征符合大肠杆菌的特性(见表1)。大肠杆菌两种基因的PCR鉴定均为阳性，条带大小与预计大小一致。

表1 140株大肠杆菌生化鉴定结果

⊕：产酸产气；+：阳性；-：阴性

2.2 昆明市农贸市场大肠杆菌毒力基因分布 本研究对140株大肠杆菌12个毒力基因进行检测，结果见表2。编码介导铁摄取的feoB的检出率最高，为100%；编码与血清抵抗相关的外膜蛋白的traT基因和与I型菌毛相关的fimA基因检出率次之，为99.29%；编码P菌毛的papC基因检出率最低为21.43%。91.67%的毒力基因检出率在50%以上。

昆明市农贸市场各区大肠杆菌feoB毒力基因全部检出。cvaC、irp2基因西山区检出率低于其他区，而iroN和iutA基因西山区的检出率高于其他区，iss毒力基因在五华区和西山区的检出率相差不大，均低于其他区。papC、tsh基因分别在五华区、盘龙区检出率最低。各区的feoB、fimA、fyuA、iroN、irp2、iucC、iutA、traT基因检出均在50%以上。每个区的papC毒力基因检出率在50%以下。

表2 大肠杆菌相关毒力基因的分布

注：A：呈贡区；B：官渡区；C：盘龙区；D：五华区；E：西山区

2.3 毒力基因数量分布情况 见表3。

表3 毒力基因数量分布情况

本试验中每株大肠杆菌同时携带不少于5个毒力基因，大于20株同时携带8～11个毒力基因。5株(3.57%)同时携带12个毒力基因(见表3)。

同时携带HPI强毒力岛的标志基因fyuA和irp2两个基因的检出率为81.43%。31.43%的菌株同时携带不少于4个毒力基因(iss、irp2、papC、tsh、cvaC)。134株至少含有2个以下iutA、iss、tsh、iroN、irp2、cvaC 6种毒力基因。

3 讨论

大肠杆菌病属人兽共患病，发病机制不仅与血清型有关还与所携带的毒力基因有关[3]。根据以往研究对APEC、EPEC、EHEC、ETEC、UPEC及非致病性大肠杆菌的毒力基因比较分析，证明APEC至少含有以下4个毒力基因：astA、iss、irp2、papC、iucD、tsh、vat、cva/cvi，而禽非致病性大肠杆菌的含量少于3个毒力基因[5]。由此可见，对禽致病性大肠杆菌毒力基因的种类和携带率进行检测具有重要的实践指导意义。

董向磊[6]对APEC的feoB、traT、iroN、iucC毒力基因的检出率分别为：97.6%、87.43%、76.64%、74.85%。王利勤[7]对APEC的tsh、iutA、iss、papC毒力基因检出率分别为：61.8%、70.3%、55.6%、20%。李叶芳等对APEC的irp2和fyuA检出率都为100%[8]。本试验检测了禽源性大肠杆菌毒力基因的携带率，得出了feoB(100%)、traT(99.29%)、iroN(75.29%)、tsh(65%)、papC(21.43%)、iss(58.57%)、iucC(73.57%)、iutA((62.14%)、irp2(87.14%)、fyuA(92.86%)，与上述研究基本一致。

金文杰等研究发现，禽源致病性大肠杆菌中fyuA+irp2基因的检测率为44.9%[9]。Ons等研究发现，鸡源致病性大肠杆菌fyuA毒力基因检出率为53.1%[10]。王利勤研究发现，鸡源致病性大肠杆菌分离株的irp2、fyuA基因的检出率分别为66.6%、77.8%，fyuA+irp2基因的检出率为60.9%[7]。本试验对fyuA、irp2毒力基因的检出率分别为92.86%、87.14%，fyuA+irp2基因的检出率为81.43%。均比上述试验结果偏高。这说明昆明市农贸市场禽源性大肠杆菌中HPI的携带率高，与菌株的致病性密切相关。

本试验对昆明市农贸市场各区大肠杆菌毒力基因进行了检测，除feoB、fimA、traT基因外，其他基因在每个区存在很大差异，这间接反映了昆明市各农贸市场鸡来源可能不同，同时反映出昆明市周边地区鸡场致病性大肠杆菌的携带率亦可能不同。

综上所述，昆明市各农贸市场鸡肝大肠杆菌的毒力基因之间存在差异，并且大肠杆菌的致病性与毒力基因携带的种类和携带率有关，大肠杆菌携带毒力基因的种类越多、携带率越高致病性越强。本试验对禽源性大肠杆菌的流行病学调查和毒力基因的携带率提供了一定的理论依据。

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[4] 刘文强, 贾玉萍, 赵宏坤. 16S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用[J]. 动物医学进展, 2006, 27(11):15-18.

[5] Ewers C, Janssen T, Kiessling S,etal. Rapid detection of virulence-associated genes in avian pathogenicEscherichiacoliby multiplex polymerase chain reaction[J]. Avian Dis, 2005, 49(2):269-273.

[6] 董向磊. 禽致病性大肠杆菌的分离鉴定和分离株毒力基因与致病性相关性研究[D]. 扬州:扬州大学, 2014.

[7] 王利勤. 鸡源致病性大肠埃希菌耐药基因及毒力基因检测研究[D]. 杨凌:西北农林科技大学, 2014.

[8] 李叶芳, 白灏, 彭开松, 等. 禽致病性大肠杆菌强毒力岛摄铁功能与致病性关系的研究[J]. 中国兽医科学, 2012,36(9):906-910.

[9] 金文杰, 郑志明, 秦爱建, 等. 禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查[J]. 中国兽医科学, 2006, 36(10):787-790.

[10] Ons E, Bleyen N, Tuntufye H N,etal. High prevalence iron receptor genes 43 of avian pathogenicEscherichiacoli[J]. Avian Pathol, 2007, 36(5):411-414.

2016-01-20

云南省优势特色重点学科生物学建设项目(50097505)；云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队(51400605)

杨娟(1992-)，女，硕士生，研究方向为动物疫源疫病，E-mail：m18788189620@163.com

吴培福，E-mail：jed-wu2008@126.com

S852.61+2

B

0529-6005(2017)02-0086-02