保健食品毒理学与功能动物学试验中应该注意的一些典型问题

国家食品药品监督管理总局保健食品审评中心（100070）蔡铁全

北京市保健品化妆品技术审评中心（100053）刘彬 周立新

北京市药品检验所（北京市保健食品化妆品检验中心）（100035）赵晋燕 胡宇驰 金鑫

随着生活水平的提高和人们对自己健康状况的重视，对保健食品的研究也不断深入。本文总结了近年来进行保健食品毒理学试验和功能验证动物学试验研究中出现的一些问题，希望从事保健食品研究与试验的实验室能够互相借鉴，避免工作中的一些失误。

1 试验设计中的问题

1.1 剂量设计不合理 保健食品作为特殊食品一般来说相对安全，有些实验室在进行毒理学试验的时候未能充分考虑受试样品的所有检测试验的要求。例如，急性毒性试验仅仅是试验剂量达到5g/kgBW，但受试样品并不是最大的溶解度、最大的给予体积。遗传毒性试验因为需要达到试验要求的10g/kgBW给予受试样品，这样就导致急性毒性试验受试样品的使用浓度和剂量均低于遗传毒性试验剂量。一般来说，急性毒性试验必须采用最大溶解度和最大灌胃容积来进行MTD试验，并应该尽量做到一日内给予剂量不小于10g/kgBW。

30天喂养试验设计时，应该想办法使高剂量达到人用剂量的100倍或100倍以上；如果成品添加到饲料中也不能达到100倍以上时，应该适当减少辅料或者直接采用原料来进行试验，从而尽量达到符合要求的安全倍数的要求。如果是液体受试样品，必须采用适当的方法提高剂量（如浓缩受试样品），以保证30天喂养试验的给予倍数达到100倍以上。进行喂养试验时，当受试样品的掺入量高于5%时，应添加酪蛋白，并应该说明酪蛋白添加量的计算过程。剂量设计中，如果需要去掉受试样品中含有的某种成分时，去除后给予受试样品的剂量和人体实际使用剂量之间的折算关系也应有计算说明，应合理设计。

1.2 测定指标不合理 主要是指标严重缺失。例如急性毒性试验中未测定给予受试样品后动物的体重变化；精子畸形试验中观察“尾折叠”时，没有详细说明判定标准；30天喂养试验中未按要求测定体重、摄食量、食物利用率、脏器重量，测定的血液学、血清生化学指标有缺项；受试样品具有某些功效，但是在毒性试验中未观察到相关的改变。（如具有促进排便功效的样品，在进行急性毒性试验及30天喂养试验的时候未观察动物排便情况。）

1.3 对照品选择不合理 Ames试验中阳性诱变剂的选择不合理（如在进行+S9试验时，TA102的阳性对照不应选择顺铂，而应选择1，8-二羟基蒽醌）；受试样品配制使用溶媒和阴性对照组给予的受试物不一致（如受试样品使用蒸馏水配制，却以植物油作为阴性对照组）；当受试样品中含有酒基的时候，未设定酒基对照组；Ames试验两次试验不能共用一个阳性对照组，每次试验均应设定阳性对照组。

1.4 受试物的处理不合理 样品处理时不能保证样品的稳定性：当受试样品中含有维生素E或者鱼油时，试验采用掺入法给予动物，不能合理解释如何保证所含的维生素E不被氧化或鱼油在掺入饲料后还能具有良好的稳定性。

溶媒选择不合理：如非水溶性的受试物选择蒸馏水溶解，含有蜂胶、大豆油、卵磷脂成分的样品采用蒸馏水溶解是不妥当的；不同试验采用不同的溶媒进行受试样品的稀释，例如：某一受试样品，急性毒性试验、精子畸变试验及微核试验用2%淀粉溶液做溶媒，而Ames试验、30天喂养试验用蒸馏水做溶媒。实际上，设计中应注意同一受试样品的毒理学、功能学试验的溶媒应相同。

样品预处理不合理：无菌试验的受试样品未灭菌即行试验；灭菌操作方法未进行详细说明，如采用高压灭菌时未注明灭菌的温度、时间。采用过滤灭菌时未说明采用何种滤膜，孔径。灭菌方法不合理（如受试样品中含有不耐热的活性物质，却采用高压灭菌的方法除菌或者是采用非常规的的灭菌条件未能说明使用该条件的理由）；Ames试验中采用的受试样品含有组氨酸或者是糖类、其他氨基酸类的成分，当这类成分能够影响结果的判断时，在试验时未除去影响的成分或者是处理的过程、方法没有详细的描述；Ames试验的受试样品中组氨酸的含量较低，不会诱发回复突变频率增高，试验前去除组氨酸却没有说明去除的理由；30天喂养试验时候使用去除辅料的受试样品，未说明去除辅料的方法或者是去除辅料样品的来源；乙醇含量超15%时，未将乙醇含量降低到15%。

2 试验过程中的问题

2.1 试验结果的处理不合理 试验结果未选择适当的统计方法进行统计学处理：主要有各受试样品组的参比组错误（应与阴性对照组/空白对照组进行比较）；当受试样品组与阴性对照组（空白对照组）进行比较，差异具有显著性意义的时候未进行标注，也未进行相关的分析说明；试验结果中的每一项具有显著性差异的检测指标未逐一标注并说明。例如：30天喂养试验中某次测定的食物利用率低于其他测定值，未进行相应的说明；血清生化学测定指标、血液学测定指标中的某项指标低于或高于对照组，未说明原因。

2.2 未注意试验数据与背景数据比较 每个实验室均应有自己的相关背景数据积累，如正常动物微核的千分率，正常小鼠精子畸形的种类及发生率。试验得到的数据应注意与背景数据的比较，科学分析试验结果与试验数据的毒理学意义。

例如Amse试验中：阴性对照自发回变率超出参考值未说明原因；阳性对照的自发回变率、精子畸形试验和微核试验的阳性对照组的精子畸形率、微核率低于文献报道时，没有相关分析；当试验结果超出一般的范围时，未结合本实验室的背景数据进行分析。

30天喂养试验中测定的血液学、血清生化学指标受试样品组与对照组的检测指标有差异时，未进行分析，未提供本实验室的背景数据及测定的质控数据。

组织病理学检查中发现某种病理改变在多只动物身上发生，没有分析说明该种病变发生的原因（如是否为动物的自发病变，是否与受试样品有关）；当组织病理学检查发现动物出现病变时，在病理检查报告中没有详细说明病变的种类，病变发生的数量，发生病变的动物的性别。

2.3 试验中原始记录不详细 试验的原始记录应当用签字笔手写或填写表格中有关内容，必须做到真实、及时、准确和完整，并规范化和表格化。原始记录不能只包括数据收集，还要证明所有程序都是按照要求在正确的时间正确实施，做到规范记录，不得漏记和随意涂改，不得伪造、编造数据。如果数据缺失或没有完整的试验记录，试验的正确性将受到质疑。例如使用的材料信息不全：生化试剂盒缺乏使用说明书，不记录生化试剂的批号、来源等，不记录阳性对照物的批号、来源等。特殊管理的试剂，没有按照国家规定进行管理，例如麻醉药品、遗传毒性试验使用的阳性对照品没有出入库记录，没有配制、使用与废弃记录等。有的试验，实际结果是由仪器记录生成的数据，结果仪器中缺乏原始文件，只有手写的数据记录。

2.4 试验中使用材料不符合规范要求 例如实验动物的体重不符合试验要求、实验动物的级别不符合要求。

3 试验报告中的问题

3.1 未注意全文的前后一致性 全文的内容描述前后不一致或使用单位符号不统一。例如：毒理学报告中要求应表示为mg/kgBW或ml/kgBW，但报告中的实际样品浓度及给予剂量与设计样品浓度及给予剂量不一致（原始资料中设计剂量为10g/kgBW，检查报告中为8g/kgBW），或者检查报告中前后描述不一致（方法部分描述的剂量为10g/kgBW，结论部分变为8g/kgBW），或者报告中与原始记录不一致（原始记录中记录为mg/kgBW，但报告中为ml/kgBW）。

3.2 报告结果不规范 例如表格中数据的表示不符合要求：检验报告表格中的数据一般以均值±标准差表示。精子畸形试验、微核试验结果中，畸形率、微核率、PCE/RBC（PEC/NCE）不是以均值±标准差表示的，且精子畸形试验结果未列明畸形的类型；用词用语不规范：报告中判定结论“无毒物”规范为“无毒级”。

3.3 报告结果的不完整 包括未提供相关材料信息：如未提供与实验动物相关的材料（动物合格证号、生产许可证号、使用许可证号）。当要求使用特定级别、性别、体重的动物时，试验报告中未进行说明。关键的试验方法应进行说明，以保证能够重现试验。例如受试物的配制方法在报告中应进行简明扼要的叙述，但有的报告中配制的方法不明确，无称量体积，无加入溶媒的量，最终浓度等配制方法的描述。

3.4 报告的真实性存在质疑 如某受试样品的受理日期为2008年3月18日，毒理学试验报告签发日期为2006年3月11日，动物功能试验报告签发日期为2006年1月10日，功能试验报告及毒理学试验报告的签发日期远远早于受试样品的受理日期。

4 小结

综上所述，在目前巨大的市场需求的前提下，各实验室应该努力提高本单位的试验水平，同时认真解读所使用的检测标准，本着严谨、科学的态度完成检测试验，出具检测报告。