甘草饮片标准汤剂的研究

林伟雄+乐智勇+车海燕+刘荫贞+刘冲+王晖

[摘要]制备了15批不同产地的甘草饮片标准汤剂，对甘草苷和甘草酸进行含量测定，计算转移率与出膏率，并建立了HPLC指纹图谱分析方法。通过对15批甘草饮片标准汤剂进行测定，甘草苷和甘草酸转移率范围分别为59.4%～87.4%和49.8%～78.9%，出膏率范围为29.9%～38.9%，并用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）软件进行指纹图谱分析，确定了10个共有峰，对15批甘草饮片标准汤剂分别进行了相似度评价，其相似度均大于0.9。该研究中甘草饮片标准汤剂制备方法规范，15批样品质量稳定，指纹图谱相似度高，其方法精密度、稳定性和重复性良好，可为甘草配方颗粒的质量控制提供参考。

[关键词] 甘草； 标准汤剂； HPLC； 指纹图谱

[Abstract] Fifteen batches of Glycyrrhizeae Radix standard decoction were prepared for determination of the content of the glycyrrhizic acid and liquiritin， then the transfer rate and the extract rate were calculated and a method was established to analyze the fingerprint by HPLC. According to the measurement of 15 batches of samples，the transfer rate of the glycyrrhizic acid and liquiritin were 59.4%-87.4% and 49.8%-78.9% with extract rate of 29.9%-38.9%. Moreover，10 common chromatographic peaks were determined based on their fingerprint by using similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine （TCM）（2012A） .The similarity results of 15 batches of samples were analyzed and compared，and the results showed that the similarity was all higher than 0.9. Fifteen batches of samples，prepared by a standard method，have stable quality and the high similarity.The method displayed good precision，stability and repeatability in fingerprint analysis. Therefore，this study can provide a reference for the quality control of Glycyrrhizae Radix dispensing granules.

[Key words] Glycyrrhizae Radix； standard decoction； HPLC； fingerprint

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草G. inflata Bat.或光果甘草G. glabra L.的干燥根和根茎^[1]。始载于《神农本草经》，列为上品，素有“国老”之称，是常用中草药^[2-3]，中医处方离不开甘草，俗称“十方九草”^[4-5]。具有清热解毒，补脾益气，润肺祛痰，缓急止痛，调和诸药的作用^[6-7]。现代研究表明，甘草的主要活性成分为黄酮类和皂苷类，甘草苷具有保肝及抗抑郁样作用，甘草酸具有抗炎、保肝、抗病毒及类固醇样作用，且在治疗肾病、心脏疾病及抗癌等方面有着广泛的应用^[8]。

随着科技的发展与进步，配方颗粒、精制饮片、超微饮片、破壁饮片等多种中药饮片用药形式不断出现，具有积极的临床意义，但也存在标准不明确、剂量不统一、临床合理性有待进一步论证等各种问题^[9]。为加强对中药配方颗粒的管理，国家食品药品监督管理总局起草了《中药配方颗粒管理办法》，要求应体现配方颗粒多成分和整体性质量控制，2016年8月5日，国家药典委员会进一步公布《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，提出标准汤剂概念，明确要求中药配方颗粒的所有药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与标准汤剂质量一致性。

中药饮片标准汤剂可作为一种化学基准，同时还可以作为效应基准的阳性对照药，用于评价不同饮片的用药形式，用于标化临床用药，其制备遵循传统汤剂的煎煮原则，整个流程具有标准化和规范化的特点，能够保证工艺的统一，进一步保障其质量的稳定和统一，提高临床用药的准确性和剂量的一致性^[9]。中药饮片标准汤剂失去了原有饮片的形态学特征，单纯的指标成分的定性和定量分析难以反映其质量的优劣，因而中药饮片标准汤剂质量控制要重视以指纹图谱为主的整体质量控制^[9]。本实验选用不同产地的15批甘草制备甘草饮片标准汤剂，考察了有效成分含量，转移率和出膏率范围，并主要建立其HPLC指纹图谱，为甘草饮片标准汤剂的应用和其他中药饮片标准汤剂的研究提供参考数据，同时提高甘草配方颗粒的质量控制水平。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，配备G1311C四元泵，G1316A恒温箱，G1315DDAD检测器，G1329A自动进样器，Chem Station色谱工作站；XP6型电子分析天平（METTLER TOLEDO，精密度0.001 mg），XPE205型电子分析天平（METTLER TOLEDO，精密度0.000 1 g），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），Arium 611DI型超纯水仪（德国Sartorius公司）。

乙腈（色谱纯，155803，赛默飞世尔科技）；超纯水（自制）；磷酸（分析纯，20080304，广东光华化学厂）；乙醇（分析纯，20160708，天津福晨化学试剂）。

甘草苷（批号111610-201607）、甘草酸铵（批号110731-201418）对照品和甘草（批号120904-201117）对照药材均购自中国食品药品检定研究院；15批甘草药材来源见表1，甘草饮片标准汤剂由康美（北京）药物研究院有限公司自制。

2 方法与结果

2.1 甘草饮片标准汤剂的制备

2.1.1 甘草前处理 根据《中国药典》2015年版四部通则0213炮制通则，按《中国药典》2015年版一部甘草项下炮制方法进行炮制，除去杂质、洗净、润透、切厚片、干燥制得。炮制加工得到的饮片按《中国药典》2015年版第一部甘草饮片项下有关规定进行检测，均符合规定。

2.1.2 标准汤剂的制备^[10] 称取甘草饮片100 g，加水煎煮2次。第1次加入水900 mL，浸泡30 min，煮沸后再煎煮1 h，用350目筛网趁热滤过，滤液迅速放入冷水中搅拌冷却；药渣再加入水700 mL，煮沸后再煎煮30 min，用350目筛网趁热滤过，滤液迅速放入冷水中搅拌冷却；合并2次滤液，减压浓缩（50 ℃，-0.09 MPa）至100～200 mL的流浸膏，放入冰柜冷冻（-10 ℃）过夜，用冷冻干燥机干燥，即得标准汤剂干燥粉末。

标准汤剂是甘草饮片经水煎煮提取加工制得的粉末，主要成分为甘草药材中水溶性物质，参照《中国药典》2015年版第一部甘草项下的含量测定方法，考察了供试品制备方法，并对其方法进行方法学验证，建立了甘草苷和甘草酸2个成分的含量测定方法，并计算其出膏率和转移率，结果见表2。

结果显示，15批标准汤剂出膏率在29.9%～38.9%，平均出膏率为33.0%，标准偏差为2.7%；甘草苷的质量分数在2.25%～8.25%，平均质量分数为4.90%，标准偏差为2.4%，转移率在59.4%～87.4%，平均转移率为76.7%，标准偏差为8.0%；甘草酸的质量分数在5.97%～14.80%，平均质量分数为9.79%，标准偏差为2.6%，转移率在49.8%～78.9%，平均转移率为66.2%。标准偏差为6.9%。

2.2 色谱条件及系统适用性

Waters symmetry C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，19%A；8～45 min，19%～50%A）；检测波长237 nm；流速1 mL·min^-1；柱温25 ℃。精密吸取参照物和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录空白溶液、参照物和供试品的色谱图，结果见图1～3。

2.3 溶液的配制

2.3.1 供试品溶液的配制 取本品粉末約0.1 g，置具塞锥形瓶中，加入100 mL的70%乙醇，密塞，称重，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每 l mL含甘草苷20 μg、甘草酸铵0.2 mg的溶液，即得。

2.4 HPLC-DAD指纹图谱分析

2.4.1 精密度考察 按2.3.1项下方法制备同一批标准汤剂供试品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以甘草酸色谱峰为参照，对各主要共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A）计算相似度。结果表明相对保留时间RSD<0.50%，相对峰面积RSD<1.0%，相似度为1，说明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.4.2 稳定性考察 按2.3.1项下方法制备同一批标准汤剂供试品溶液，按2.2项下色谱条件，分别在0， 2， 4， 8， 12， 24 h时测定，记录色谱图，以甘草酸色谱峰为参照，对各主要共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A）计算相似度。结果表明相对保留时间RSD<1.7%，相对峰面积RSD<3.0%，相似度>0.99，说明供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱要求。

2.4.3 重复性考察 取平行制备的同一批标准汤剂干燥粉末样品6份，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图，以甘草酸色谱峰为参照，对各主要共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A）计算相似度。结果表明相对保留时间RSD<0.50%，相对峰面积的RSD<2.0%，相似度为1，说明该方法重复性良好，符合指纹图谱要求。

2.4.4 样品检测与分析 分别取15批甘草饮片标准汤剂干燥粉末，按2.3.1项下方法制备得标准汤剂供试品溶液，再按2.2项下色谱条件分别测定，记录HPLC图。将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A）中，采用自动匹配法生成共有模式对照图谱，并分析各样品之间共有峰和相似度，确定共有峰，结果确定了15批样品共有10个共有峰，见图4，5，各指纹图谱与共有模式对照指纹图谱相似度均在0.9以上，符合指纹图谱相似度要求。具体结果如下，S1 0.961；S2 0.953；S3 0.963；S4 0.927；S5 0.952；S6 0.975；S7 0.984；S8 0.990；S9 0.988；S10 0.987；S11 0.981；S12 0.988；S13 0.981；S14 0.995；S15 0.988。以选定的峰面积相对较大、出峰时间较稳定的10号峰甘草酸作为参比峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果其相对保留时间RSD<0.20%，相对峰面积差异较大，RSD介于20%～48%。

2.4.5 对照药材与标准汤剂指纹图谱的相关性 为了验证制备工艺的科学性和稳定性，用甘草对照药材制备供试品溶液，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图，与标准汤剂对照指纹图谱进行对比，验证其相关性。结果表明，对照药材和标准汤剂对照指纹图谱相似度很好，有较多相同的成分。结果见图6。

3 讨论

3.1 甘草药材来源

为保证标准汤剂的代表性，本实验甘草药材的来源尽可能地包括了道地产区、主产区、传统产区的规范化种植药材和野生药材，主要采自新疆人工种植甘草药材、山西和甘肃野生甘草药材。

3.2 标准汤剂制备工艺合理性

本实验甘草饮片标准汤剂以中医理论为指导、临床应用为基础，参照国家药典委员会公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》和《医疗机构中药煎药室管理规范》，利用现代提取设备，用经标准化工艺制备而成的甘草饮片，以水为提取溶剂，采用物理方法分离固液、低温减压浓缩、冷冻干燥，制得样品。实验中考虑到固液分离对成分得率的影响较大，采用趁热过滤方式进行固液分离，二煎过后的药渣进行了适当压榨处理，减少了成分的损失，趁热过滤后，滤液放置冷水中迅速冷却，抑制了各成分的热分解，同时采用低温减压浓缩、冷冻干燥方法提高煎煮液中各成分的稳定性，保证了其质量的稳定，最大限度上达到与传统汤剂一致的目的。

3.3 供试品溶液制备方法考察

本实验考察了提取溶剂（乙醇、70%乙醇、50%乙醇），结果表明乙醇提取的供试品溶液中信号峰最少，70%乙醇和50%乙醇提取的供试品溶液中信号峰较多，共有成分提取效果相近，与甘草苷和甘草酸参照峰相应的峰峰形和分离度均良好，最终确定采用70%乙醇提取；同时考察了提取方式（回流和超声），结果发现回流和超声提取效果一致，因此采用操作简便的超声提取。

3.4 色谱条件的考察

标准汤剂是甘草饮片经水煎煮提取加工制得的粉末，主要成分为甘草药材中水溶性物质，本实验参照《中国药典》2015年版一部甘草项下的含量测定方法，选用237 nm为检测波长，以流动相乙腈-0.05%磷酸溶液进行梯度洗脱，结果表明，45 min之后没有明显的特征峰，故梯度洗脱时间和记录色谱图的时间定为45 min，最终确定其洗脱方式（0～8 min，19%A；8～45 min，19%～50%A）；同时比较不同生产厂家（Waters， Merck， Kromasil）色谱柱的分离效果，根据特征峰的数量、分离度和各个特征峰的峰形，决定采用Waters symmetry C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

3.5 指纹图谱相似度评价分析

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A）相似度分析结果显示15批甘草饮片标准汤剂与对照指纹图谱的相似度均高于0.9，表明各批甘草饮片标准汤剂具有较高的均一性，質量相对较稳定，说明本实验建立的甘草饮片指纹图谱中10个共有峰及对照指纹图谱可反映其指纹特征，具有鉴别评价意义。其相对保留时间RSD均小于0.20%，说明不同产地和不同批次的样品有较多相同的成分，但相对峰面积差异较大，RSD介于20%～48%，说明不同产地和不同批次的样品含量差异较大，可能与原料质量有关。

3.6 应用

本实验目的是为甘草配方颗粒的研究制定质量控制标准参照物，根据15批标准汤剂的研究结果显示各批甘草饮片标准汤剂具有较高的均一性，质量相对较稳定，说明其可作为配方颗粒的质量控制标准参照物。以标准汤剂的检测数据为依据，可为甘草配方颗粒制定各项指标，保证成品与标准汤剂质量一致性。

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[责任编辑 丁广治]