6株枝孢霉的鉴定与分析

廖焕兰，柏彩英，陈富，李松，张文，屈平华，张伟铮

（1.广州中医药大学第二附属医院 广东省中医院检验科，广东 广州 510006；2.广东省妇幼保健院检验科，广东 广州 510010）

6株枝孢霉的鉴定与分析

廖焕兰1，柏彩英2，陈富1，李松1，张文1，屈平华1，张伟铮1

（1.广州中医药大学第二附属医院 广东省中医院检验科，广东 广州 510006；2.广东省妇幼保健院检验科，广东 广州 510010）

目的 利用ITS基因序列分析对临床分离的6株枝孢霉进行分子生物学鉴定与分析，以提高对枝孢霉的鉴定能力。方法从皮肤病患者中分离6株枝孢霉，通过观察培养后菌落的形态及其显微镜下特征，并利用ITS序列对其进行PCR分子生物学分析，并将PCR产物送公司进行测序。结果6株枝孢霉由显微镜下的形态和培养的菌落特征鉴定，提取其DNA进行PCR扩增，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，再由Tanon-3500凝胶成像系统确定扩增所得电泳带的大小在500～750 bp之间，测序结果经Blast比对，其中4株鉴定为球孢枝孢霉100%，1株鉴定为枝孢样枝孢霉100%，1株鉴定为枝孢霉属97%。结论通过ITS基因序列分析技术，能更有效准确地提高对枝孢霉的鉴定能力，为临床的准确治疗方案提供有力的依据。

枝孢霉菌；ITS基因序列分析；PCR分子技术

枝孢霉是近些年常报道的引起暗色真菌皮肤病的常见真菌，治疗起来也较为困难，还因其广泛的存在于自然环境中，特别是在免疫力低下的老年人或者外伤等直接接触条件下常可导致人和动物的感染，如甲真菌病和真菌性皮肤病，严重的可引起肺部感染等[1]，目前，对枝孢霉的微生物学特征和所致的病情尚缺乏一定的了解，对其所致的暗色皮肤病的诊断与治疗存在很大的困难，并且枝孢霉的显微镜下的形态特征以及培养后菌落的特点与其他暗色真菌的极其相似，如分生孢子的形态、菌丝隔的颜色深浅和分生孢子的生长方向等等，更何况暗色真菌培养后的菌落特点与平板的种类、培养的环境以及培养时间的影响很大，通过主观的判断难免会有所误差。由此，仅从镜下的形态和培养后的菌落特点对其鉴定会有一定的误诊，那么能提高对枝孢霉的鉴定能力就显得至关重要。因此，本文对临床上6株鉴定的枝孢霉进行ITS基因序列分析[2]，通过对比分析前后的结果，能更好的提高对这类真菌的鉴别能力，为临床的准确治疗方案提供有力的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年6月至2016年4月本院的5例皮肤科门诊的患者和1例皮肤科住院的患者，其临床表现为均有典型的真菌皮肤病的特征，经甲屑或皮屑真菌镜检为阳性，并进一步进行真菌培养后，通过形态上以及培养特点而鉴定为枝孢霉属6例标本。

1.2 直接镜检及培养 ①取材：用刀片刮取或用胶布贴住少量患者病患部位的皮屑或直接剪下部分患病的甲屑；②直接显微镜检查：将刮取的皮屑标本于玻片上，然后盖上盖玻片,然后在盖玻片旁加入1～2滴10%的KOH溶液，静置后直接镜检；或直接贴住胶布直接镜检；③真菌培养：将刮取的病患部位的皮屑或患病的甲屑直接嵌入(SDA)沙氏培养基中，于25℃的培养箱中培养10 d左右，大约4 d可以看到真菌的生长，之后隔天取出观察菌落的生长情况、表面的形态和颜色的变化等情况，并拍照留底和做好记录。

1.3 菌株的鉴定 于SDA培养基中转种至马铃薯琼脂培养基(PDA)中，于25℃进行分离培养。在培养过程中记录根据菌落的颜色、菌落的生长速度、菌落的大小和表面及背面的特征，再综合培养后的真菌在镜下的形态特点，如分生孢子的形态、颜色及数量，分生孢子梗的形态特征及菌丝的长短宽厚等特征以及直接镜检的形态特点等来进行鉴定。

1.4 分子生物学鉴定 利用真菌通用的引物进行ITS序列分子学测定，以鉴定菌种。使用真菌通用引物ITS4、ITS5对纯培养后真菌提取的DNA片段进行PCR扩增，然后将所得的PCR产物送往上海的美吉生物医药科技有限公司进行双向测序[3]。将检测的测序结果在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中进行比对以鉴定菌种。

1.5 仪器与试剂 自配的10%KOH，沙氏培养基(SDA)，马铃薯琼脂培养基(PDA)，恒温培养箱，Tanon-3500凝胶成像系统(上海天能)，奥林巴斯显微镜，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)等。

2 结 果

2.1 菌落形态 将刮取的病患部位的皮屑或患病的甲屑直接嵌入(SDA)沙氏培养基中，于25℃培养约10 d，约第4天就开始长出菌落，之后隔天取出培养基观察菌落表面的形态、菌落表面的质地的变化和菌落颜色的变化，记录菌落的生长情况，第9天左右菌落长的比较完整，此时可见菌落的质地的变化由柔软到粉末状再到羊毛样，菌落的生长方向从中央向四周分散，从SDA培养基的前面可见颜色逐渐变黑，背面观察为黑色，部分菌落形态见图1。

2.2 镜下的特征 直接挑取SDA平板上的菌落涂片进行显微镜检查，镜下可见菌丝为细枝状，为有隔菌丝，隔的颜色为棕色，菌丝可见有分枝，有分生孢子梗，分生孢子成串状并呈顶端生长。部分镜下形态见图2。

图1 左为平板正面，右为平板背面

图2 枝孢霉菌的镜下形态(×400)

2.3 PCR扩增后的电泳结果 取SDA培养基上的菌进行PCR扩增，扩增的产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，再由Tanon-3500凝胶成像系统进行检测，最后所得的电泳条带为500～750 bp(见图3)。

图3 6株真菌的电泳图

2.4 测序结果 PCR的扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序，测序结果可见图4。将获得的序列输入生物技术信息网进行Blast分析比对(www.ncbi.him.nih.gov/blast)，得出4株为球孢枝孢霉(100%)，1株为枝孢样枝孢霉(100%)，1株为枝孢霉属(97%)。

图4 三种枝孢霉的测序图

3 讨 论

枝孢霉能引起的暗色真菌皮肤病的种类有很多，在本院中检出的主要为球孢枝孢霉和枝孢样枝孢霉，由于在自然界中枝孢霉广泛存，那么与其接触的机会也会相应增多，甚至在一些常见的动物的体表也存在，如野鼠身上也有发现[4]。机体因皮肤的外伤而接触感染源后则有被感染的机会，特别是有基础疾病的老年人、免疫力低下的患者，最极其容易由于接触后被感染，轻则引起皮肤表面的瘙痒、溃烂。也可引起皮下组织的炎性肉芽肿、脓肿等，严重还会引起系统性感染的深部真菌病，治疗起来将非常困难，而且治愈后也极易复发。由于目前霉菌的药敏操作起来比较复杂，且在操作的过程中也可能有一定的危险性，所以开展霉菌药敏实验的医院很少，而临床治疗上往往都是根据经验用药或根据检验科的鉴定报告进行用药治疗。也就是说，除了经验用药外，准确鉴定就是选择用药的最好选择。而不同的菌种对不同的真菌药物的药敏性是有差异的，如一般的暗色真菌对氟康唑的较为敏感，临床上也较为常用，而枝孢样枝孢霉则对氟康唑的敏感性较差[5]，因此，霉菌的准确鉴定对临床上的治疗效果有着非常重要的作用。

目前对霉菌的鉴定主要还是依靠培养后的菌落的生长速度、表面的质地感的变化和颜色的变化以及培养前后的镜下的形态来进行初步的辨别，主观性大，加上培养后的菌落形态变化的影响因素较多，所以难免会有鉴定有误的发生，进而影响或延误了患者的治疗。而今，随着分子生物学不断的发展，PCR技术不断的进步，在真菌学上的研究特别是菌种鉴定能力也得到了很大程度的发展，特别在基因分子诊断方面也有日新月异的进步，近年来，真核生物基因组中编码核糖体的基因rDNA的间隔区为内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)的扩增序列检测，是在真菌的鉴定方面最为常用的，也是目前真菌鉴定的金标准，由于操作繁琐以及费用昂贵，一般的医院都未能开展。近年有人提出，皮肤癣菌鉴定的金标准就是直接从临床标本上获得的真菌rDNA的ITS序列分析[6]，随着ITS序列检测的应用和发展，其对真菌种属的鉴定已成为最好的选择之一。

本文检测的6例真菌患者的标本，根据镜下的特点和培养前后的菌落特征最后鉴定为枝孢霉，从大的方向来说，这菌属诊断还是比较准确的，但对种的诊断就很困难了。因此，本文就是通过利用ITS基因序列对进6例标本进行分析诊断，利用真菌的通用引物ITS4、ITS5对纯培养后真菌提取的DNA片段进行PCR扩增，然后将所得的PCR产物送往上海的美吉生物医药科技有限公司进行双向测序，测序结果在GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中进行比对，最终确定结果为4株球孢枝孢霉(100%)，1株枝孢样枝孢霉(100%)，1株枝孢霉属(97%)。通过ITS基因序列的诊断鉴定可以提高鉴定能力[7]，对枝孢样枝孢霉感染患者的治疗就起到非常重要的作用。

总之，真菌的种类多种多样，形态和感染方式又极为相似，而我们对许多真菌的微生物学特性了解又甚少，所以真菌的诊断是非常困难的。但是，随着分子生物学的不断进步，经过ITS序列检测的结果，再去比较之前的鉴定，从中学习经验，对这类真菌的鉴别能力也必定会提高的。

[1]桑红,何威,郑稀,等.枝孢样枝孢霉对小鼠致病性实验研究[J].医学研究生学报,2008,21(1):25-27.

[2]刘彦威,刘娜,柳焕章,等.兔须癣毛癣菌的分离与鉴定[J].动物医学进展,2013,34(6):39-42.

[3]张伟铮,邓光远,蓝锴,等.基于ITS序列鉴定阿萨希毛孢子菌及体外药敏分析[J].中国热带医学,2014,14(7):773-776.

[4]桑红,王丽,贺丹,等.枝孢状枝孢霉与常见致病性暗色真菌基因多态性研究[J].中华医院感染学杂志,2010,20(1):16-19.

[5]高适.枝孢样枝孢霉对抗真菌药物的药敏性实验研究[J].医学信息:医药版,2009,22(4):6-7.

[6]张静,黄怀球,薛汝增,等.致脓癣的须癣毛癣菌鉴定及体外药敏试验[J].中国真菌学志,2009,4(3):152-154.

[7]朱敏,耿佳靖,王玫,等.ITS和β-微管蛋白基因序列鉴定曲霉菌的临床应用[J].中华检验医学杂志,2011,34(4):353-357.

Identification and analysis of six strains of Cladosporium.

LIAO Huan-lan1,BO Cai-ying2,CHEN Fu1,LI Song1, ZHANG Wen1,QU Ping-hua1,ZHANG Wei-zheng1.1.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine/Guangdong Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou 510006,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children Hospital, Guangzhou 510010,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo perform molecular biological identification and analysis of six strains ofCladosporiumclinically by ITS gene sequencing,and to improve the ability to identifyCladosporium.MethodsSix strains ofCladosporiumwere isolated from the patients with dermatosis.Colony characteristics and microscopic morphology of the isolates were observed by methods of culture and direct microscopy.PCR analysis of the isolates was performed by ITS gene sequencing and the PCR product was sent for sequencing.ResultsSix strains ofCladosporiumcould be identified by microscopic morphology and colony characteristics.DNA was extracted for PCR analysis,and PCR product was analyzed on 1%agarose gel electrophoresis.The size of product was 500-750 bp using Tanon-3500 gel imaging system.By BLAST,four isolates displayed 100%consistence withBeauveria Cladosporium,one showed 100%consistence withcladosporium cladosporioides,and one had 97%consistence withCladosporium.ConclusionITS gene sequencing can identifyCladosporiumeffectively and provide strong basis for clinical treatment.

Cladosporium;ITS gene sequencing;PCR analysis

R379

A

1003—6350（2017）06—0920—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.021

2016-09-17)

广东省科技计划项目(编号：粤科社字2011 106号)

张文。E-mail：13610235698@163.com