TRAIL抗肿瘤的优化研究进展

郭志兰，车路阳，孙震晓，刘长振

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.中国中医科学院 医学实验中心北京市重点实验室，北京 100700；3.解放军总医院 骨科，北京 100853

TRAIL抗肿瘤的优化研究进展

郭志兰1,2，车路阳3，孙震晓1，刘长振2

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.中国中医科学院 医学实验中心北京市重点实验室，北京 100700；3.解放军总医院 骨科，北京 100853

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员。因其具有选择性杀伤绝大多数肿瘤细胞而对人体正常细胞无明显细胞毒性的特性而被广泛研究，并已有相关制剂进入临床抗肿瘤研究。虽然TRAIL在体内外实验中均展现出良好的抗肿瘤效果，前期临床研究结果也表明了其相对安全性，但其临床抗肿瘤效果却不太理想。总结其临床效果差的主要原因，可能有体内稳定性差、肿瘤靶向性差、肿瘤获得性耐受等。对于TRAIL临床疗效差的问题，许多针对性的研究也相应开展，目前已有不少报道表明通过一些合理的优化方式有可能解决上述问题。我们从TRAIL的基因治疗、重组蛋白及死亡受体抗体治疗、TRAIL联合用药治疗及其他治疗方法等方面，简要综述TRAIL在抗肿瘤方面的应用及其应用中的优化。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）；抗肿瘤；稳定性；靶向性；耐受

目前肿瘤的治疗手段主要是传统的手术治疗辅以药物化疗及（或）放射治疗，然而传统的放化疗法因在杀伤肿瘤细胞的同时对人体的正常细胞也产生较大伤害，导致病人的不良预后及生存质量下降。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumornecrosisfactorrelated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）能选择性杀伤肿瘤细胞而对人体正常细胞无明显的毒副作用，为更好地治疗肿瘤开辟了新的道路。随着研究的深入，TRAIL在抗肿瘤应用中的一些问题也逐渐出现，对其相应的改进优化也在不断探索中。

1 TRAIL及其受体

1.1 TRAIL概况

TRAIL是1995年Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出的肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，与细胞凋亡配体1（apoptosis-1 ligand，Apo 1L）具有较高的同源性，故其亦被命名为Apo 2L[1]。

TNF家族是一类多功能细胞因子，参与多种细胞功能及生命过程调控，包括细胞的抗病毒、免疫调节功能及生长、分化、凋亡过程等[2]，其中3种分子——TNF-α、Fas-L和TRAIL可通过与相应受体的结合将死亡信号传入细胞，诱导凋亡[3]。与前两者比较，TRAIL的不同之处在于：①具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力，但对正常细胞无明显的细胞毒性；②有更广的抗癌谱；③TNF-α和Fas-L会导致人体产生严重的炎症反应，而TRAIL对NF-κB仅有微弱激活作用。因此，TRAIL被认为是一种更为安全且极具潜力的抗肿瘤因子[4]。

1.2 TRAIL受体

与TNF家族其他成员一样，TRAIL的活性单位为同源三聚体，在与细胞表面特异性受体结合后发挥功能。目前已确认了TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）共5种TRAIL的不同受体[5]。根据功能和结构的不同，可将TRAIL受体分为3类：①死亡受体（death receptor，DR），包括DR4（TRAILR1）、DR5（TRAILR2），两者均含死亡结构域并能向细胞内传递死亡信号，当TRAIL与DR结合时，能够触发TRAIL诱导细胞凋亡；②诱骗受体（decoy recep⁃tor，DcR），包括DcR1（TRAILR3）、DcR2（TRAILR4），两者胞外区均有2个与DR4、DR5高度同源的富含半胱氨酸的重复序列，但DcR1缺失胞质区域死亡结构域，DcR2只包含短的但无功能的死亡结构域，故两者能与TRAIL结合却不能传导凋亡信号，当TRAIL与DcR结合时，可以逃逸TRAIL诱导的凋亡，抑制细胞凋亡途径[6]；③OPG，是一种分泌性蛋白质，在体内主要作为NF-κB受体活化因子配体（receptor activator for NF-κB ligand，RANKL）的诱导受体，起减少破骨细胞数量、增加骨密度、促进骨质沉积的作用[7-8]。

2 TRAIL在肿瘤治疗中的应用

TRAIL因其特异性杀伤肿瘤且抗癌谱广而具有广泛的临床应用前景，但其在实际临床应用中的效果却不尽如人意。下面将对迄今TRAIL在肿瘤治疗中的主要应用方式及优化做简要综述。

2.1 TRAIL的基因治疗

TRAIL的基因治疗主要是指用真核病毒载体转染靶细胞后，通过表达的TRAIL来杀伤靶细胞。目前研究较多的病毒载体主要是腺病毒（ad⁃enovirus，Ad）和腺相关病毒（adeno-associated vi⁃rus，AAV）。Yang等[9]构建了包含全长TRAIL基因的腺病毒载体Ad-TRAIL，转染NSCLC细胞系包括YTMLC、GLC、A549及H460等细胞后均导致细胞活力明显下降且凋亡率增加；在接种了YTMLC的裸鼠肿瘤内注射Ad-TRAIL后明显抑制了裸鼠体内肿瘤的生长。Shi等[10]构建了携带可溶性TRAIL基因的重组腺相关病毒载体rAAV2/5-sTRAIL，在A549细胞感染实验中引起了细胞的明显凋亡；在异种移植及原位移植肺癌荷瘤小鼠模型中，rAAV2/5-sTRAIL的介入治疗明显减少了肿瘤的生长并延长了小鼠存活时间；此外该载体对体外培养的人原代肝细胞和荷瘤小鼠多个器官均无毒性，因此有望成为治疗肺癌的一种有效方法。对TRAIL基因治疗的优化改进方案也在不断摸索中。Wang等[11]构建的由人端粒酶逆转录酶hTERT启动子调控TRAIL表达的腺病毒载体AAV-hTERT-TRAIL，其中hTERT启动子作为一种肿瘤组织特异性启动子可以使AAV-hTERTTRAIL的肿瘤靶向性大大提高。Chen等[12]结合肿瘤组织中低氧环境的特性及减毒鼠伤寒沙门杆菌能在肿瘤低氧环境中特异性生长的特点，构建了受低氧诱导的启动子调控的能分泌表达TRAIL的沙门菌株VNP20009，结果表明VNP20009能特异性靶向肿瘤细胞并分泌TRAIL，显著促进黑色素瘤细胞的凋亡、抑制黑色素瘤的生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。Luo等[13]巧妙地设计了由具有抗癌活性的双胍作为脂质体头部的阳离子脂质体DOBP，并用DOBP包裹TRAIL质粒进入脂质体-鱼精蛋白-DNA（LPD）纳米粒中形成DOBPLPD-TRAIL的纳米微粒来进行基因运输。一方面该结构协同了TRAIL与双胍的抗肿瘤作用，另一方面新的DOBP载体作为基因运输的形式避免了病毒载体可能导致的免疫原性反应，为拓宽TRAIL基因治疗肿瘤谱提供了新可能。

2.2 TRAIL重组蛋白及DR抗体

第一代TRAIL重组蛋白及DR抗体的临床前研究表明其抗肿瘤效果均较理想，Ⅰ期临床研究结果证明了两者在一定使用剂量下的安全性[14]，但后期的临床疗效却皆不尽如人意。

早期研究较多的TRAIL重组蛋白主要有全长、胞外区部分以及添加His或Flag标签序列的TRAIL，而其中有效、无肝毒性并顺利进入Ⅰ期临床研究的只有由TRAIL第114～281位残基组成的不含标签的重组蛋白Apo2L.0（AMG-951/Dulaner⁃min）。虽然Ⅰ期临床结果表明其对人体安全，但治疗效果却不理想[15-16]。抗DR4/DR5的DR抗体效果也类似，如人源抗DR4的单克隆抗体（Mapa⁃tumumab/HGS-ETR1）和人源抗DR5的单克隆抗体（Lexatumumab/HGS-ETR2、HGS-TR2J）对肾癌、膀胱癌及前列腺癌等泌尿生殖系统的癌细胞具有明显的诱导凋亡作用，Lexatumumab对体内肾癌种植模型也具有明显的抗肿瘤作用[17]，但两者均未达到临床治疗疗效[18]。总结TRAIL重组蛋白和DR抗体临床疗效差的主要原因可能有：①稳定性差，血液中半衰期短导致生物活性降低而无法充分发挥其促凋亡效用；②靶向性差，绝大多数血液中的重组TRAIL或DR抗体无法到达相应的肿瘤部位而导致效用降低。针对这2点，对重组TRAIL或DR抗体相应的改造优化也不断发展。

增加其稳定性的方法主要包括对其结构自身稳定性进行优化、与具有良好药动学性质的成分结合及一些剂型上的优化等。Rozanov等[19]构建的含有亮氨酸拉链（LZ）的LZ-TRAIL嵌合体同天然TRAIL类似，以三聚体的形式发挥作用，但稳定性却大大提升，由原来报道的数分钟的半衰期延长至超过一小时，并且在体内外实验中均表现出高效且特异性的杀伤肿瘤效果。人血清白蛋白（HSA）及PEG是近年研究较多的药动学性质良好的成分，许多科研人员尝试将两者与TRAIL结合，并取得了不错的结果。Kim等[20]将TRAIL装载到HSA纳米颗粒中，使得TRAIL的半衰期明显延长，生物活性显著升高。Li等[21]则将HSA高亲和力的配体与TRAIL结合，使其能与体内的HSA结合并以HSA为载体进行运输，增加了TRAIL的稳定性及抗肿瘤效果。与PEG结合则是又一种优化TRAIL生物活性的方式。Kim等[22]利用聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）微球缓释系统装载并运输PEG-TRAIL，与TRAIL微球相比，PEG-TRAIL微球起始突释率低、持续诱凋亡时间长、持续释药时间长，且体内抗肿瘤效果更好，未发现明显的副作用。

增加其靶向性的思路主要是通过scFv-TRAIL的形式将TRAIL与分子相对较小的单链抗体（scFv）融合[23]，因scFv可特异性靶向肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的特异性高表达抗原，故可显著提高TRAIL对肿瘤的靶向性。Edwin等[24]设计了scFvC54-sTRAIL，其中C54片段能特异性结合EGP2，一种在许多人类癌细胞（如结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌等）表面高表达的抗原，进而达到靶向结合并杀伤癌细胞的效应。次年，Ed⁃win等[25]又报道了靶向CD7抗原构建的融合蛋白scFvCD7-sTRAIL，其中CD7作为一种在绝大多数T细胞瘤表面表达的糖蛋白，具有一定特异性。结果证实scFvCD7-sTRAIL能特异性地对急性T淋巴细胞白血病细胞产生明显的促凋亡效应，而对正常人血细胞及内皮细胞无明显毒副作用。Liuqin等[26]构造的Ad-KDRscFv-sTRAIL则是通过Ad-KDRscFv靶向血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体KDR，因KDR主要在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞表面表达，进而将TRAIL聚集到肿瘤组织部位。Ad-KDRscFv-sTRAIL不仅增强了TRAIL的靶向性，同时阻断了VEGF与KDR的结合，抑制肿瘤血管生成，降低微血管密度，在体内外实验中都展现出良好的抑瘤效果。Trebing等[27]将靶向人CD70的scFv（lαhCD70）与添加了韧黏素C（TNC）的相对TRAIL更稳定的TNC-TRAIL连接形成融合蛋白scFv-lαhCD70-TNC-TRAIL。CD70作为一个免疫调节分子，在多种肿瘤组织中广泛表达，尤其是在肾癌、成神经胶质瘤及多种血液肿瘤中，而在正常细胞中较少表达，因此具有一定的靶向性。结果表明scFv-lαhCD70-TNC-TRAIL对于CD70特异性表达的肿瘤具细胞具有明显的特异性死亡诱导效应。

另外还存在一些兼顾增强稳定性和靶向性的改进方案。Kim等[28]通过两步N端特异性PEG化的方法将转铁蛋白（transferrin，Tf）通过PEG与TRAIL结合，得到Tf-PEG-TRAIL，Tf具有肿瘤靶向性、PEG化能够通过延缓肾脏代谢分泌而有效延长药物在体内的停留时间，实验结果也证明了Tf-PEG-TRAIL的靶向性及稳定性与TRAIL相比有了明显提升，抗肿瘤效果也明显提高，有望成为肿瘤治疗的有效药物。

2.3 TRAIL的联合用药

研究表明，TRAIL不仅单独使用时具有抗肿瘤功效，而且与多种药物之间存在抗肿瘤的协同作用。

比较常见的是其与一些常规化疗药物的联合使用，在协同促进诱导肿瘤凋亡的同时，因化疗药物用量的减少而大大降低化疗药物带来的副作用。顺铂是一种被广泛用于多种实体肿瘤临床治疗的化疗药物。Li等[29]的研究表明其与TRAIL的联用在体内外实验中均能明显抑制对TRAIL耐受的卵巢癌细胞生长；Yin等[30]指出，其与TRAIL的联用对抗雌性激素药耐受的乳腺癌细胞表现出良好的杀伤作用，有望成为抗雌激素耐受的乳腺癌患者治疗的新策略。紫杉醇是另一类联用化疗药物。Hunter等[31]指出，对紫杉醇耐受的小细胞肺癌细胞在紫杉醇与TRAIL联用时出现明显的凋亡，其机制可能与一些非Caspase凋亡蛋白相关的凋亡诱导因子的活化相关；Li等[32]研究指出，紫杉醇与TRAIL的联用使原本对TRAIL耐受的胃癌细胞出现明显的凋亡反应，显著增强了TRAIL的抗肿瘤活性，其机制可能与MAPK信号通路的抑制有关。其他联用的化疗药物如多柔比星、依托泊苷、奥沙利铂等[33-38]在实验室阶段均表现出逆转部分肿瘤细胞的耐药性或增强TRAIL杀伤作用的效果。

一些与TRAIL抗性相关蛋白的抑制剂如组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）、蛋白酶体抑制剂、热激蛋白（HSP）抑制剂、PI3K抑制剂等与TRAIL联合也可增强TRAIL的抗肿瘤效果。这些抑制剂主要是通过修复TRAIL抗性产生过程中一些错误的细胞进程，包括表观遗传调控、蛋白质合成、折叠及降解、代谢过程的失调等来逆转肿瘤细胞对TRAIL的抗性[39-41]。

此外，许多中药成分也可促进TRAIL的抗肿瘤功效。研究较多的如雷公藤内酯可与TRAIL结合对多种肿瘤细胞，如肺癌、前列腺癌、胰腺癌及肾细胞癌等起到协同杀伤作用[42-45]。许多研究表明姜黄素也可显著增强TRAIL对许多肿瘤，如神经纤维瘤蛋白缺陷的恶性周围神经鞘膜肿瘤（MPNST）、乳腺癌、卵巢癌等的细胞毒性[46-48]。其他中药成分如黄芩素、苦参黄素、白藜芦醇、青蒿脂、木樨草素等[49]也被报道可逆转肿瘤细胞对TRAIL的抗性或增强TRAIL的抗肿瘤活性。

联合用药还可以进一步与增强TRAIL稳定性和靶向性相结合。Thao等[50]利用HSA以纳米颗粒的形式共运输多柔比星和TRAIL，实现了与化疗药物的联合并具备了纳米药物稳定性好、生物利用度高、靶向性强和缓释的功能，在对结肠癌的体内外研究中均表现出了卓越的抗肿瘤效果。

2.4 其他

TRAIL与干细胞治疗、免疫疗法的结合同样是研究者的努力方向。Cihui等[51]报道了一种双重靶向治疗非霍奇金淋巴瘤的体系，该体系以人源脐带间充质干细胞为载体，利用其自身的肿瘤靶向性特性迁移到肿瘤部位，分泌的scFvCD20-sTRAIL进一步靶向CD20特异性表达的肿瘤细胞，为非霍奇金氏淋巴瘤的治疗带来新希望。

除上述几种TRAIL应用方式外，现有研究还尝试将微生物与TRAIL结合来治疗一些相关肿瘤。Fabien等[52]使用一种食物级别的益生菌——费氏丙酸杆菌作为TRAIL在结直肠癌治疗中的佐剂。结果表明经费氏丙酸杆菌发酵过的牛奶、DMEM培养基上清或发酵的短链脂肪酸代谢产物（丙酸和乙酸）能显著增强TRAIL诱导的结直肠癌细胞凋亡，而对人的正常肠道上皮细胞无细胞毒作用，为临床结直肠癌的治疗提供了新思路。

3 总结与展望

TRAIL的发现可以说是抗肿瘤研究历程中的重大事件之一。其对肿瘤细胞的选择性杀伤而对绝大多数正常细胞无细胞毒性使得该蛋白成为抗肿瘤界的明星分子。对于TRAIL的相关机制及应用研究很多，相应的一些制品也已进入临床研究。然而尽管前期实验阶段TRAIL的抗肿瘤效果显著，临床验证结果却不尽如人意。其主要原因大致为：①TRAIL在体内的稳定性差，半衰期短，生物利用率低；②TRAIL的靶向性差，大部分TRAIL无法到达肿瘤区域，而在血液循环过程中逐渐失活；③一些原本对TRAIL敏感的肿瘤细胞变得对TRAIL耐受。针对TRAIL的稳定性及靶向性，研究者们从不同角度对TRAIL的性能尝试了多种方式的优化并取得了一定进展，包括对TRAIL自身结构的优化、添加药动学性质较好的分子增加稳定性并改善药动学性质；与靶向肿瘤表面特异性抗原的scFv融合增加靶向性；利用能够靶向肿瘤且增加TRAIL稳定性的载体进行运输及释放等。针对肿瘤细胞对TRAIL的耐受，目前的主要方法就是联合用药，包括与化疗药物及一些天然产物的联合。针对TRAIL的这些改进方案已不再局限于分子细胞生物学领域，还涉及药代动力学、免疫学、材料学、制剂等，不同领域的优势结合将为肿瘤的治疗带来新希望。

尽管上述关于TRAIL优化的几种治疗方案目前在实验阶段都表现出了良好的抗肿瘤效果，且相比于单一的TRAIL基因、TRAIL蛋白或DR抗体在生物活性方面也都有明显改善，但其安全性方面仍有许多须验证的地方，如TRAIL基因治疗所用的病毒载体是否会引起人体免疫反应，TRAIL结构的修饰是否会导致其对正常细胞产生细胞毒性，肿瘤抗原scFv是否足够特异、是否会杀伤正常细胞，如果对正常细胞有杀伤，抗肿瘤与对正常细胞的伤害可否折衷，等等。这些问题还需要进一步的动物实验及临床验证。

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[52]Cousin F J,Jouan-Lanhouet S,Théret N,et al.The probiotic Propionibacterium freudenreichii as a new ad⁃juvant for TRAIL-based therapy in colorectal cancer [J].Oncotarget,2016,7(6):7161-7178.

Advances in Optimization of TRAIL in Anti-Tumor Appli⁃cation

GUO Zhi-Lan1,2,CHE Lu-Yang3,SUN Zhen-Xiao1*,LIU Chang-Zhen2*
1.College of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102;2.Beijing Key Laborato⁃ry of Research of Chinese Medicine on Prevention and Treatment for Major Diseases,Experimental Research Cen⁃ter,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700;3.Department of Orthopedics,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;China

As a member of tumor necrosis factor（TNF）superfamily,tumor necrosis factor related apoptosis-in⁃ducing ligand（TRAIL）is well known for its capability to induce apoptosis in a wide range of tumor cells while having minimal toxicity to normal human cells.Thus,there are many researches related to TRAIL,and some agents targeting TRAIL receptors（TRAILR）have been into the clinical period.Although TRAIL showed great po⁃tential in tumor killing in preclinical period and its safety was verified in the early clinical result,its anti-tumor effects in clinical therapy is not satisfied.The main reasons for the poor effect may include:a short half-life in vi⁃vo，poor tumor targeting ability and acquired resistance to TRAIL.To deal with this defection of TRAIL,numerous related studies are in progress,and,excitingly,a number of reports have revealed that appropriate optimization of TRAIL in such as structure,dosage form and adjuvants combination is of great potential.In this review,the antitumor application of TRAIL and its optimization process were summarized from TRAIL gene therapy,recombinantTRAIL and agonists targeting death receptors,TRAIL combination and other therapy strategies.

tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）;antitumor;stability;targeting abili⁃ty;acquired resistance

Q25

A

1009-0002（2017）02-0175-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.023

2016-08-25

国家自然科学基金（31170829,81171762,81550017,81473418）；中国中医科学院自主选题项目（zz2015015）

郭志兰（1992-），女，硕士研究生

刘长振，（E-mail）lcz0220@163.com；孙震晓，（E-mail）sunzxcn@hotmail.com

*Co-corresponding anthors,LIU Chang-Zhen,E-mail:lcz0220@163.com;SUN Zhen-Xiao,E-mail:sunzxcn@hotmail.com