中等强度耐力训练后心肌损伤标记物及能量代谢通道变化的机制研究

李 欣

(成都大学 体育学院， 四川 成都 610106)

中等强度耐力训练后心肌损伤标记物及能量代谢通道变化的机制研究

李 欣

(成都大学 体育学院， 四川 成都 610106)

探讨了中等强度耐力训练后大鼠心肌损伤标记物心肌肌钙蛋白、脑钠肽和能量代谢通道哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和AMP依赖的蛋白激酶信号通路变化的作用机制.利用健康雄性SD大鼠60只，随机分为耐力运动组和对照组，建立大鼠耐力运动型心肌肥大模型.使用免疫组化结合计算机图像处理技术，对心脏形态结构以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的分布和表达进行观察和测定；使用real-time PCR技术，对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和AMP依赖的蛋白激酶的mRNA表达进行测定；使用ELISA检测方法，对大鼠血清心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、脑钠肽的表达进行测定.8周中等强度耐力训练后：E组大鼠心脏组织未见形态学病理性改变；E组大鼠的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白免疫反应阳性面积和光密度显著上调(P<0.05)；E组大鼠AMP依赖的蛋白激酶的mRNA表达未见显著改变，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的mRNA表达显著上调(P<0.05)；E组大鼠心脏血浆脑钠素、血浆肌钙蛋白T和肌钙蛋白I表达升高，但未见显著变化.结果表明：8周中等强度耐力训练导致的耐力训练型心肌肥大未发生心功能恶化和慢性心衰；训练后心肌肌钙蛋白和脑钠肽表达升高并不能直接反映心肌细胞坏死和心功能恶化，其变化应是由心脏形态结构功能重塑造成的；8周的中等强度耐力训练未造成大鼠心肌细胞能量环境的改变；中等强度耐力训练中，心肌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和AMP依赖的蛋白激酶信号通路的表达与骨骼肌存在显著差异.

耐力训练；心肌肌钙蛋白；脑钠素；mTOR/AMPK；信号通路

0 引 言

长期大强度耐力训练后，运动员左心室腔在舒张末期增大，提示了病理性扩张型心肌病发生的可能，表明耐力运动性心肌肥大具有心血管疾病发展的风险[1].而中等强度耐力训练是否也会对心脏结构形态和功能产生不良影响目前未见系统明确的报道.临床上通常将血液心肌肌钙蛋白(I/T)作为判断心肌细胞坏死最具敏感性和特异性的指标[2]，将脑钠肽作为判断心肌功能和预后心衰的最具敏感性和特异性的指标[3].哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路是心肌细胞能量代谢变化的感受器，能感受运动时肌肉收缩所引起的能量变化，从而在机体对运动的适应性反应中发挥重要作用[4].因此，本研究通过8周中等强度的跑台训练后大鼠心脏形态结构的显微检测、mTOR/AMPK信号通路表达的变化以及心脏损伤标志物的表达变化，来确定中等强度耐力训练导致的心肌肥大性质，心脏损伤标志物在运动损伤临床意义，心肌细胞能量代谢变化情况以及心肌mTOR/AMPK信号通路的变化情况与骨骼肌细胞是否存在不同.

1 对象与方法

1.1 实验动物

实验动物为60只健康雄性SD大鼠，3月龄，质量180～210 g，随机分为耐力训练组(E组，n=30)和对照组(C组，n=30).每组内包括3个平行亚组，即形态学检测亚组(C1/E1组，n=10)、实时荧光定量PCR检测亚组(C2/E2组，n=10)和ELISA检测亚组(C3/E3组，n=10).大鼠采用标准啮齿类饲料(四川大学实验动物中心提供)饲养，自由饮水与活动，室温22 ℃±2 ℃，湿度45%±10%，昼夜节律人工控制光照，光照时间为12 h/d.

1.2 跑台训练计划

利用自制动物跑台建立中等强度耐力训练动物模型.耐力训练组大体采用Fenning的训练计划[5]，结合Wisloff对最大摄氧量的控制方法[6]，每周训练6 d，持续训练8周.整个训练过程中，相对运动强度大约维持在60%～65%VO2max.

1.3 形态学检测亚组取材与测量

整个训练计划结束后24 h，C1组和E1组大鼠苯巴比妥钠(4 mg/100 g体质量)腹腔麻醉后，心脏灌注固定后取出心脏，电子天平称重，计算心脏体质量指数.心脏石蜡包埋，切片，进行HE染色，观察组织结构.对mTOR进行免疫组织化学DAB显色反应实验，反应结果在显微镜下观察、摄片.图像分析软件使用Image-Pro Plus 6.0，参数值由图像分析系统自动产生.测量参数为每个视野各测试指标阳性反应区域的平均光密度与总面积.

1.4 实时荧光定量PCR检测

整个训练计划结束后24 h，C2和E2组大鼠苯巴比妥钠(4 mg/100 g体质量)腹腔麻醉后，迅速取出完整心脏，置于液氮中备用.取心脏组织块50～100 g用液氮在研钵中加Trizol研磨成粉末状后移入离心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，振荡，冰上孵育5 min后，4 ℃离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，振荡，冰上孵育5 min后，4 ℃离心10 min，弃上清液，加入1 ml 75%乙醇，振荡后，4 ℃离心5 min，弃上清液后室温下使之干燥，加入DEPC处理水10 μL溶解RNA.琼脂糖凝胶电泳检测完整性后，使用RT-PCR将mRNA反转录成cDNA待用.使用逆转录试剂盒(Farmentas MBI), 并按试剂盒说明书进行操作.加4 μL RNA样品于冰上放置的EP管中，1 μL的oligo(dT)，加无菌无酶水至总体积为12 μL.混匀后离心5 s，70 ℃温浴5 min，再于冰上按顺序加入：4 μL 5×buffer、1 μL RNasin(20 u/μL)、2 μl 10 mM dNTP mix.混匀后短暂离心，37 ℃孵育.加1 μL的M-MLV(200 u/μL)，至反应终体积为20 μL.42 ℃孵育1 h，70 ℃温浴10 min，冰上放置.产物-20 ℃保存.

1.5 引物设计与REAL-TIME PCR反应

在Gene Bank中进行目的基因全序列查找，采用Primer Express 3.0设计软件设计引物，引物序列及其相关信息见表1.

表1 各基因引物序列及相关信息

将各目的基因按照10倍浓度梯度稀释，选择1/10、1/100、1/1 000和1/10 000稀释浓度的样品作为标准品模板，进行实时荧光定量PCR反应.通过这4个标准品生成的反应数据，由Multicolor Real-Time PCR detection system自动生成标准曲线，根据各标准品拷贝数的对数与其对应的Ct值可建立一个方程.当R2>0.95时，可认为标准曲线建立成功[7].

1.6 ELISA检测亚组取材与实验

整个训练计划结束后24 h，C3组和E3组大鼠苯巴比妥钠(4 mg/100 g体质量)腹腔麻醉后，左心室心尖部取血，静置15 min后，离心15 min(4 000 r/min，室温)，取上清液，-20 ℃保存.使用全波长酶标仪测量血清心肌肌钙蛋白T/I和脑钠肽的吸光度，按说明书制作标准曲线，得出回归方程后，计算各样品中心肌肌钙蛋白T/I和脑钠肽的浓度.

1.7 实验数据处理

使用SPSS 17.0处理相关数据，两组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为具有显著性差异.

2 实验结果

2.1 大鼠心脏质量指数的变化

大鼠心脏质量指数变化如表2所示.

表2 大鼠心脏质量指数

注：*与C组比较P<0.05.

由表2可知，实验结束后，E组大鼠心脏质量低于C组，但不具有显著性差异；E组大鼠质量显著低于C组(P<0.05)；E组大鼠心脏质量指数增大，与C组比较具有显著性差异(P<0.05).

2.2 心肌组织HE染色观察

大鼠心肌组织HE染色观察如图1所示.

图1 大鼠心肌组织结构观察(放大200倍)

由图1可见，C组大鼠心室肌横切面纤维结构清晰，呈短柱状(图1-A)；纵切面纤维结构清晰，呈不规则长条形(图1-B).E组大鼠心肌纤维结构清晰，横纹明显，可见肌纤维体积较C组有一定的增粗，未见变性和坏死现象(图1-C、图1-D).

2.3 心肌组织mTOR免疫组织化学法结合计算机图像处理检测

大鼠心脏组织mTOR免疫染色结果见图2.

图2 大鼠心肌组织mTOR免疫组织化学观察(放大200倍)

由图2可见，C1组(2-A)大鼠心肌细胞中存在少量mTOR免疫阳性反应染色.E1组(图2-B)大鼠心肌细胞中存在mTOR免疫阳性反应染色.与C1组相比，免疫阳性反应明显增强，棕黄色颗粒染色密度明显增加.计算机图像处理结果见表3.

表3 大鼠心脏组织mTOR表达图像分析结果

注：*与C1组相比，P<0.05.

2.4 实时荧光定量PCR检测结果

目的基因mTOR的Real-time PCR标准曲线见图3，目的基因AMPK的Real-time PCR标准曲线见图4.mTOR和AMPK基因相对表达水平见表4.

图3 mTOR的标准曲线和回归方程

图4 AMPK的标准曲线和回归方程

组 别mTOR表达水平AMPK表达水平C2组(n=9)25．61±3．1740．26±4．00E2组(n=9)35．59±4．09∗38．09±2．87

注：*P<0.05.

由表5可知，E2组大鼠mTOR表达显著高于C2组，P<0.05；E2组大鼠AMPK表达虽然高于C2组，但无显著性差异.

2.5 心脏血清脑钠肽和血清肌钙蛋白T/I ELISA检测结果

大鼠血清脑钠肽和血清肌钙蛋白T/I的标准曲线和回归方程见图5～7，各组BNP和血清肌钙蛋白T/I的表达比较见表5.

图5 大鼠血清BNP的标准曲线及回归方程

图6 大鼠血清心肌肌钙蛋白T标准曲线及回归方程

图7 大鼠血清心肌肌钙蛋I标准曲线及回归方程

分组脑钠肽/(ng/L)心肌肌钙蛋白T/(ng/L)心肌肌钙蛋白I/(ng/L)C2组121．36±6．5231．21±1．5668．05±4．20E2组121．53±3．8731．57±1．2268．51±1．73

注：与C组比较P>0.05.

由表5可知，E3组大鼠血清脑钠肽以及血清心肌肌钙蛋白T/I的表达虽然高于C3组，但无显著性差异.

3 分析和讨论

3.1 中等强度耐力训练对心脏组织学形态的影响

实验发现，实验动物造模结束后，E组大鼠的质量明显低于C组，心脏质量指数显著增加，表明大鼠耐力运动型心肌肥大模型建立成功.E组大鼠心脏质量未发生显著性变化，这与部分实验结果相符[6].其原因可能是耐力训练主要造成心室腔的扩大，而心室壁无需过度增厚，心脏质量不会发生显著性变化，也可能是实验训练周数较短，心脏的绝对质量增加程度尚不明显所致[7].实验中，E组大鼠的心脏体积增大，心室腔扩大，心肌纤维增粗；形态学检测发现，大鼠心肌纤维结构清晰，横纹清楚可见，未见心肌纤维间显著水肿、嗜酸性染色增强、血管扩张与局限性间质水肿等病理性改变.

3.2 中等强度耐力训练对心脏mTOR/AMPK信号通路表达的影响

mTOR是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞营养状态、能量状态的传感器，它处于PI3K/Akt信号通路的下游，在调节细胞生长和细胞周期中起非常关键的作用[8].AMPK是真核生物能量代谢变化的感受器，能感受运动时肌肉收缩所引起的能量变化，从而在机体对运动的适应性反应中发挥重要作用[9].由于其细胞能量调节器的作用，mTOR/AMPK信号通路在心肌肥大，尤其是病理性心肌肥大中扮演重要角色：一方面，病理性的刺激，如运动中产生的缺血缺氧可迅速激活AMPK，导致心肌糖代谢增加和脂质过氧化，而这正是病理性心肌肥大的重要特征；另一方面，AMPK的激活可以抑制下游靶蛋白的活性，从而抑制心肌细胞蛋白合成和肥大进程[10].因此，本实验通过心脏mTOR和AMPK的表达变化，来判断中等强度耐力训练后心肌细胞中能量的变化情况与心肌细胞mTOR/AMPK信号通路的变化情况.

实时荧光定量PCR检测和免疫组化检测发现，E1组和E2组大鼠心脏mTOR的表达较对照组均发生了显著性提高，表明在中等强度耐力训练刺激下大鼠心脏mTOR的激活，而实时荧光定量PCR检测发现，E2组大鼠心脏AMPK的mRNA表达较C2组大鼠的表达均值降低了5.7%，但统计学检测不具有显著性差异，说明在中等强度耐力训练刺激下大鼠心脏AMPK并没有被激活.由于当细胞内出现营养剥夺或缺氧时，细胞内AMPK的含量会显著增高，由此可以推测，中等强度耐力训练后，心肌细胞的能量消耗不大，细胞内未出现营养剥夺或缺氧状态，即8周的中等强度耐力训练并没有造成大鼠心肌细胞能量环境的改变.心肌细胞的能量底物来源主要包括脂肪酸代谢和糖代谢，这2个进程都可被AMPK调节.提示AMPK的激活可能在不同的致肥大机制中扮演双重角色：当压力负荷性(或病理性)肥大时，AMPK增多，糖酵解增加，导致病理性心肌肥大继续发生；而当生理性肥大时，AMPK表达降低，蛋白合成增加，促进生理性肥大的继续发生.在本实验中，AMPK的mRNA表达下降，但没有显著性差异，至少可以表明此时的心肌肥大并不是病理性的肥大.

3.3 中等强度耐力训练对心肌和骨骼肌mTOR信号通路表达影响的异同

体外培养发现，相同细胞类型在面对不同机械刺激时，其激活的信号通路是不同的[11]，这提示虽然心肌细胞和骨骼肌细胞都属于肌细胞，但在运动刺激作用下，两者经mTOR途径合成蛋白的信号通路变化状况是不一致的.其中mTOR/p70S6K信号通路作为一条对机械刺激、营养双敏感的信号通路，很容易被细胞内能量状态感受器AMPK调节.目前，对于心肌细胞在运动刺激下mTOR/AMPK信号通路变化情况的研究未见系统的报道，按经验，心肌mTOR表达增高时，AMPK的活性应受到抑制.但在本实验中，虽然mTOR的表达发生了显著升高，却没有证据表明AMPK的活性受到了抑制，相反AMPK的表达还存在一定的提高.此结果提示在中等强度耐力训练的刺激下，心肌细胞AMPK与mTOR之间可能并不存在着相互抑制关系.而对于骨骼肌细胞来说，不同类型的运动刺激会造成mTOR/AMPK信号通路的不同变化.Nader等[12]的研究发现，长时间低强度的耐力训练造成的营养缺乏或缺氧等因素激活AMPK，下调mTOR表达.而抗阻训练则选择性抑制骨骼肌AMPK通路，从而激活TSC2/mTOR信号通路[13].

3.4 中等强度耐力训练对心脏损伤标志物的影响

3.4.1 中等强度耐力训练对脑钠肽的影响.

8周中等强度耐力训练后，有2只大鼠血清脑钠肽含量出现了显著性上升，但E3组整体脑钠肽均值只略高于C3组，未出现显著性差异.大鼠在经过8周的耐力训练后出现了运动性心肌肥大，而血清脑钠肽浓度未显著性升高，提示在生理性的运动性心肌肥大中，脑钠肽可能并未参与该过程.运动后血清脑钠肽表达上升可能是由于运动对心室壁造成牵张压力，心肌细胞中储存的脑钠肽释放入血；而经过对8周中等强度耐力训练的适应，心肌细胞中脑钠肽的基因表达和合成重新编码，大鼠心脏对容积负荷等刺激产生适应，不再加速释放脑钠肽入血，从而使血液中的脑钠肽表达不再增高[7].本实验中，8周中等强度耐力训练后，大鼠出现生理性心肌肥大，未出现心功能恶化与慢性心衰等病理改变，表明脑钠肽未参与运动心脏重塑的过程，不能直接反映心脏在运动后是否出现病理改变.

3.4.2 中等强度耐力训练对心肌肌钙蛋白的影响.

实验结果发现，8周中等强度耐力训练后，E3组中有3只大鼠的血清心肌肌钙蛋白表达出现了显著性升高，但整个E3组大鼠血清心肌肌钙蛋白均值水平与C3组相比，无显著性差异.对心肌细胞形态结构的显微检测未发现病理性改变，提示运动后血清肌钙蛋白表达高于阈值，更可能是一种生理性的可逆性的变化.心肌细胞在对中等强度耐力训练的适应过程中，会出现与骨骼肌纤维对耐力训练适应过程中相似的情况，即会在心肌细胞膜上形成一个短暂的细胞伤口，造成运动后的心肌肌钙蛋白的释放.Hickman等[14]的研究发现，在缺血状态下，心肌细胞膜表面会形成一个囊泡，心肌肌钙蛋白释放入血，但此时心肌细胞并未坏死；当缺血严重或时间过长时，囊泡破裂，心肌细胞凋亡、坏死.这可合理地解释从适宜强度到过量运动时，心肌细胞形态和血清心肌肌钙蛋白表达的变化情况，即运动能诱发心肌肌钙蛋白释放入血，但此时心肌细胞并未发生凋亡、坏死等病理改变.

目前，心肌肌钙蛋白表达的显著升高仍然是临床判断心肌细胞坏死的首选病理依据，而这种判断依据在运动医学领域是值得商榷的.本研究证实，运动后心肌肌钙蛋白和脑钠肽表达升高并不能直接反映心肌细胞坏死和心功能恶化，这种变化应是发生在心脏形态结构功能发生重塑过程中造成的心肌细胞生理性、可逆性的微小损伤.应将血清心肌肌钙蛋白和脑钠肽的表达，结合物理检测及确定心血管疾病症状后才能确诊运动后心血管功能的病变.

4 结 论

8周中等强度耐力训练导致的耐力运动型心肌肥大未发生心功恶化和慢性心衰，8周的中等强度耐力训练未造成大鼠心肌细胞能量环境的改变，心肌mTOR/AMPK信号通路的表达与骨骼肌存在显著差异.训练后心肌肌钙蛋白和脑钠肽表达升高并不能直接反映心肌细胞坏死和心功能恶化，其变化应是由心脏形态结构功能重塑造成的.

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Research on Mechanism of Markers of Myocardial Injury after Moderate-intensity Endurance Training and Changes of Energy Metabolism Pathway

LIXin

(School of Sports, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to study the working mechanism of the mTOR/AMPK signaling pathway changes and the myocardial injury markers,such as cardiac troponin,BNP and energy metabolism pathway of rats after moderate-intensity training.60 healthy male SD rats are randomly divided into control group and endurance training group.An athletic endurance myocardial hypertrophy model of those rats is established.Immunohistochemistry combined with computer image processing technology is used to observe and detect the morphology of hearts and also the distribution and expression of mTOR.Real-time PCR method is used to test the mRNA expression of mTOR and AMPK.ELISA method is also used to detect the expression of serum cardiac troponin T,cardiac troponin I and BNP of rats.The results show that after 8 weeks of moderate-intensity endurance training,1)heart tissue of rats in group E shows no pathological changes;2)The immune-positive area and optical density of mTOR immunoreaction of rats from group E is significantly enhanced(P<0.05);3)AMPK and mRNA expression of rats from group E shows no significant changes either while the mRNA of mTOR increases dramatically(P<0.05);4)The BNP,cardiac troponin T and cardiac troponin I expression of rats in group E increase but demonstrate no significant changes.The conclusion drawn is that 1)atheltic endurance cardiac hypertrophy caused by 8 weeks of moderate-intensity training does not deteriorate at all and shows no trend of chronic heart failure;2)the slightly elevation of cardiac troponinT/I and BNP after training does not reflect myocardial cell necrosis and cardiac deterioration.All the changes are caused by the remodeling of cardiac morphology and function;3)8 weeks of moderate-intensity endurance training does not lead to environmental changes of the cardiac cell energy;4)there is a significant difference between the mTOR/AMPK signaling pathway expression and cardiac muscle and skeletal muscle under moderate intensity endurance training.

endurance training;cardiac troponin;BNP；mTOR/AMPK；signaling pathway

1004-5422(2017)01-0024-06

2016-12-29.

李 欣(1980 — )， 男， 博士， 副教授， 从事运动与心血管健康研究.

G804.2

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