临床级脐带间充质细胞制备及鉴定方法研究

袁艳鹏 王淑艳 唐玺和 刘仲凤 张愚 陈志国

临床级脐带间充质细胞制备及鉴定方法研究

袁艳鹏 王淑艳 唐玺和 刘仲凤 张愚 陈志国

目的 在GLP实验室中制备并鉴定临床级脐带间充质细胞（UC-MSC）。方法 新鲜获取的脐带去除血管并进行充分清洗，获得的华通胶（Wharton’s jelly）机械分离后分别进行直接贴壁法和不同的酶消化法，比较获取UC-MSC的数量差别；用不同的无血清培养基进行培养比较细胞形态是否良好，得到最佳形态的UC-MSC。体外培养第3代后进行UCMSC质检，包括细胞活性，生长曲线，无菌检测，人类相关病毒、支原体、内毒素检测，染色体核型分析，FACS免疫表型检测及分化能力检测。不同消化方法获取细胞数之间比较采用两样本配对t检验。结果 胶原酶Ⅱ消化获得的UC-MSC数（5.3×106±0.58个/ml）与胶原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶消化法（2.53×105±0.03个/ml）及直接贴壁法（2.6×105±0.05个/ml）之间差异有统计学意义（P ＜ 0.05），与胶原酶Ⅰ消化法获取细胞数（5.1×106±0.57个/ml）之间差异无统计学意义（P = 0.07），但培养视野最干净；MesenCult-ACF Medium培养获得的UC-MSC形态最佳；UC-MSC质检细胞活性冻存前达99.8﹪，冻存复苏后达99﹪；无细菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒、肺炎支原体、EB病毒、巨细胞病毒污染；内毒素检测结果均＜ 1 EU；CD73/CD90/CD105阳性率达98﹪，CD34/CD45/HLA-DR呈阴性，阳性率＜ 2﹪；染色体核型分析无突变或缺失；UC-MSC具有成脂、成骨或成软骨方向分化的能力。结论 通过优化分离和培养条件，采用无血清及无动物来源的培养系统，在GLP实验室内可获得临床级UC-MSC。

脐带； 间质细胞； 胶原酶类； 培养基、无血清； 细胞分化

间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）最早从骨髓中发现[1]，随着MSCs的广泛应用，逐渐在多种组织中也发现了MSCs，包括脂肪、胎盘、脐带、脐血、羊膜及肌肉等[2]。……