例析稀释涂布平板法计数微生物的易错点

杨长奎　冉玲

2017年高考考试大纲新增了“微生物数量的测定”的内容。高中生物教材中有两处涉及微生物数量需要测定，一处是必修3中“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”，运用抽样检测法，在显微镜下观察统计血球计数板上酵母菌数量并推算出培养液中酵母菌的个体数；另一处是选修1中“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”，运用稀释涂布平板法，通过统计平板上的菌落数推测出样品中活菌的大致个数。其中，稀释涂布平板法计数微生物是考试的热点，也是学生的易错点。

1 易错点一：用实验组的平均菌落数与对照组菌落数的差值推算样品中活菌个数

【例1】 空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度的沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤：① 配制培养基；② 制作无菌平板；③ 设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④ 将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：

（1） 步骤③中，实验组的操作是 。

（2） 若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了

现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法 （填“正确”或“不正确”）。

解析：本实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况，应选择不同的高度放置平板，实验组的培养皿盖应揭开，使之暴露在空气中一段时间，以利于空气中微生物沉降到平板培养基表面上。空白对照组的培养皿盖不能打开，使之不接触空气，不应该出现菌落。若空白对照组平板出现了菌落，则说明空白对照组的平板被污染。对照组平板出现污染，实验组平板不一定有污染或污染程度可能不一定与空白对照组的相同。所以，用实验组获取的菌落数的平均值减去污染产生的菌落数作为实验的结果是不正确的。正确的做法是：在防止污染的情况下重新实验，以获得较准确的数据。

参考答案：（1） 将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 （2） 污染 不正确

解题指南：用稀释涂布平板法计数微生物，应设置空白对照实验（跟实验组唯一不同的是不接种或接种等量的无菌水），其目的是确定培养基制作是否合格。空白对照组如果出现了菌落，实验组的数据不能用于计算样品中的活菌数，也不能用实验组的平均菌落数与空白对照组菌落数的差值来推算样品中活菌个数。正确的做法是重新实验，直到空白对照组没有菌落出现为止。

2 易错点二：用所有重复实验组的平均菌落数来推算样品中活菌个数

【例2】 图1是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程。

（1） 图中选择培养基应以 为唯一氮源；鉴别培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成 色。

（2） 在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。每克土壤样品中的细菌数量为 个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较 。

解析：脲酶能够催化尿素分解为氨，要从土壤中筛选出产脲酶的细菌，需用以尿素作为唯一氮源的选择培养基。尿素被分解成氨，会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。将稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在细菌培养基平板上，用于计数细菌菌落数的方法是稀释涂布平板法。统计的菌落数应介于30～300，所以，选择细菌菌落数为156、178和191的平板计算出平均菌落数，即（156+178+191）÷3=175，每克土壤样品中细菌数量为175÷0.1×105=1.75×108个。由于两个或多个细菌连接在一起时，在平板上往往形成一个菌落，因此，统计的菌落数要少于样品中活菌的实际值。

答案：（1） 尿素 酚红 红 （2） 1.75×108 少

解题指南：（1） 用稀释涂布平板法计数细菌的原理是——当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2） 为增强实验的说服力和保证准确的结果，要设置对照和重复实验。设置空白对照，能排除培养基污染对实验结果产生的影响。设置重复实验（同一稀释度涂布至少3个平板，一般设置3～5个平板），并且选择菌落数在30～300的平板计算平均菌落数，再用平均菌落数推算样品中活菌数。重复实验可排除偶然因素对实验结果的影响。如果重复实验中某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程有误，应舍弃。若舍弃之后不足三个平板，如重复实验组的平板菌落数为240、250、33，则不能用这三个平板的平均值来推算样品中的活菌数，也不能用菌落数为240、250这两个平板的平均值来推算样品中的活菌数，而应找出原因并重新实验。（3） 稀释涂布平板法計数微生物的计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积，M代表稀释倍数。样品的稀释流程是将10 g土样加入到90 mL无菌水中得到稀释10倍的样液，从稀释10倍的样液中取1 mL加入到9 mL无菌水中得到稀释100倍的样液，如此进行梯度稀释。