新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂蔗糖反应行为的影响

李 梦 和静芳 李志国 苏松坤

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂蔗糖反应行为的影响

李 梦 和静芳 李志国 苏松坤

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid insecticide）目前已经成为全球范围内应用最广泛的一类杀虫剂。此类杀虫剂通过作用于昆虫的乙酰胆碱受体，释放乙酰胆碱受体抑制剂，阻碍昆虫神经传导，影响昆虫正常生理行为，最终导致昆虫麻痹死亡[1]。本文通过测定吡虫啉与噻虫胺两种新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂（Apis cerana cerana）24 h内半数致死剂量（median lethal dose，LD50）[2]，评估此类杀虫剂对中华蜜蜂的急性致死毒性。并通过统计经过亚致死剂量（sub-lethal dose）处理的中华蜜蜂，经过2 h、24 h和48 h后的伸吻反应率，从而进一步探究新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂行为的影响。

中华蜜蜂；新烟碱类杀虫剂；吡虫啉；噻虫胺；伸吻反应

1 研究背景

新烟碱类杀虫剂是一类新兴的农药，具有高效率、高选择性、高持效性、对哺乳动物低毒等特点，被广泛应用于农业生产中。新烟碱类杀虫剂包括吡虫啉（imidacloprid）、啶虫脒（acetamiprid）、噻虫胺（clothianidin）、噻虫嗪（thiamethoxam）、噻虫啉（thiacloprid）、呋虫胺（dinotefuran）及烯啶虫胺（nitenpyram）。这类杀虫剂在田间的大量使用，不仅可以有效防控有害昆虫，对于不属靶标的授粉类昆虫也有一定危害[3,4]。蜜蜂作为社会性昆虫的模式生物，在采蜜和采粉的过程中，会接触到暴露在空气中或者植物表面的残留杀虫剂，进而影响蜜蜂的行为、营养物质代谢及免疫系统[5]。关于新烟碱类杀虫剂对蜜蜂影响的报道多集中在西方蜜蜂，对于中华蜜蜂影响的研究甚少。

2 材料与方法

2.1 实验材料

福建农林大学蜂学学院中华蜜蜂实验蜂群3群，饲养盒，饲喂器，蔗糖，吡虫啉（Sigma，2016），噻虫胺（Sigma，2016），丙酮，胶带，离心管。

2.2 实验方法

2.2.1 农药的制备

将吡虫啉和噻虫胺分别溶解于丙酮中，配制成500ng/μl的母液。将母液溶解于30%的糖水中，分别配制成含有吡虫啉和噻虫胺的糖水。

吡虫啉的浓度分别为：0.5 ng/μl，1.0 ng/μl，1.5 ng/ μl，2.0 ng/μl，2.5 ng/μl，丙酮对照组浓度分别为：0.001 ng/μl，0.002 ng/μl，0.003 ng/μl，0.004 ng/μl，0.005 ng/ μl；噻虫胺的浓度分别为：0.1 ng/μl，0.2 ng/μl，0.3 ng/ μl，0.4 ng/μl，0.5 ng/μl，丙酮对照组浓度分别为：0.0002 ng/μl，0.0004 ng/μl，0.0006 ng/μl，0.0008 ng/μl，0.001 ng/μl。

2.2.2 LD50的测定

在3个实验蜂群中分别收集100只中华蜜蜂，经冷冻麻醉后，每只蜜蜂饲喂2 μl含有农药的糖水，每个浓度饲喂20只，分别放入饲养盒中恢复（对照组与处理组处理方法相同，每个蜂群重复三次）。然后，将饲喂器中装入足够量的30%的糖水插入饲养盒。将饲养盒放入恒温恒湿箱（30℃,RH:70%）培养24 h后，统计蜜蜂死亡数量，计算死亡率。

2.2.3 亚致死剂量的确定

分别用吡虫啉和噻虫胺对中华蜜蜂24 h内LD50/ 2，LD50/5，LD50/10的剂量饲喂中华蜜蜂（方法同2.2.2），24 h后统计死亡数量，并计算死亡率。

2.2.4 梯度PER

图1 蜜蜂捆绑方法

图2 蜜蜂饲喂方法

在实验蜂群中收集若干只蜜蜂，经冷冻麻醉后，用胶带将蜜蜂固定在准备好的离心管中（只允许蜜蜂的头和触角活动，图1、2），放入恒温恒湿箱恢复2 h。然后，处理组每只蜜蜂饲喂含有亚致死剂量杀虫剂的糖水，对照组每只蜜蜂饲喂含有与处理组相同质量丙酮的糖水，放入恒温恒湿箱中培养。分别在2 h，24 h和48 h后统计每只蜜蜂对0.1%，0.3%，1%，3%，10%和30%浓度糖水的伸吻反应情况，并计算伸吻反应率（图3）。

3 数据分析

3.1 LD50的测定

通过统计经过处理的蜜蜂24 h后的数量，用SPSS软件进行数据分析得出，吡虫啉与噻虫胺对中华蜜蜂24 h内LD50分别为1.942 ng/bee和0.557 ng/bee。

图3 吡虫啉与噻虫胺对中华蜜蜂伸吻反应率的影响（*代表差异性显著，0.01＜p＜0.05；**代表差异性极显著，p＜0.01)

3.2 亚致死剂量的确定

通过统计经过亚致死剂量处理的蜜蜂的死亡数量与对照组比较，发现LD50/2处理组经过24 h和48 h后与对照组死亡率都无显著性差异。因此，将LD50/2作为处理蜜蜂的亚致死剂量。

4 结果与讨论

通过新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂24 h内LD50的数据分析，噻虫胺的毒性明显大于吡虫啉，说明第二代新烟碱类杀虫剂对于蜜蜂等授粉昆虫毒性更大，药效时间更长。但通过对西方蜜蜂LD50测定的实验中看出，不同的实验中测得LD50不尽相同，这可能是由于实验条件如气候、温湿度、测定方法等因素及世界范围内蜜蜂遗传背景的差异，而造成新烟碱类杀虫剂对蜜蜂急性致死剂量的差异性。

通过PER实验数据可以看出，经过吡虫啉处理的中华蜜蜂，2 h后，处理组对0.3%，1%和3%三个浓度的糖水反应率比对照组高，但差异不显著。其它经过处理的蜜蜂与对照组相比，伸吻反应率都有不同程度的下降。其中吡虫啉处理组与噻虫胺处理组经过24 h后，其伸吻反应率与对照组相比明显下降，并表现出差异极显著。

根据文献报道，吡虫啉在进入昆虫体内20 min后，可代谢70%，经过4～5 h后可全部代谢。其中吡虫啉的五种代谢产物中，有两种含有与吡虫啉相同的药效官能团，继续作用于昆虫。但经过36 h后，昆虫可通过自身免疫机制消耗吡虫啉的代谢物[6-8]。噻虫胺作为第二代新烟碱类杀虫剂，虽与吡虫啉具有相同的药效官能团，但其代谢产物中可全部保留能与昆虫乙酰胆碱受体结合的药效基团[9]。本文实验结果证实了这种观点，经过吡虫啉处理的蜜蜂，在48 h后，对照组与处理组均表现出差异不显著。而噻虫胺处理组经过48 h后与对照组相比，对0.1%，3%，10%和30%浓度的糖水表现出差异极显著。说明噻虫胺对于蜜蜂的药效时间比吡虫啉长。

随着新烟碱类杀虫剂不断更新换代，其毒性对于蜜蜂来说也逐渐增大。更应引起我们关注的是，在面对含有新烟碱类杀虫剂的蜜粉源和不含有杀虫剂的蜜粉源时，蜜蜂更倾向于采集含有杀虫剂的植物蜜粉源[5]，这就使蜜蜂在采集过程中接触杀虫剂的可能性增加，从而影响蜜蜂健康。

中华蜜蜂是我国的特有蜂种，其对杀虫剂等农药的抵抗力很低，我们在研究新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂影响的同时，可进一步揭示其内在的免疫机制和生理防御功能，为今后更好的平衡农业发展与生态环境保护提供理论基础。

[1]Belzunces L P,Tchamitchian S,Brunet J L.Neural effects of insecticides in the honey bee[J].Apidologie,2012,43(3):348-370.

[2]Medrzycki P,Giffard H,Aupinel P,et al.Standard methods for toxicology research in Apis mellifera[J].Journal of Apicultural Research,2013,52(4):210-220.

[3]Goulson D.Neonicotinoids impact bumblebee colony fitness in the field;a reanalysis of the UK's Food&Environment Research Agency 2012 experiment[J].Peerj,2015,31(2)：390-409.

[4]Garbuzov M,Couvillon M J,Schurch R,et al.Honey bee dance decoding and pollen-load analysis show limited foraging on springflowering oilseed rape,a potential source of neonicotinoid contamination[J].Agr Ecosyst Environ,2015,203:62-68.

[5]Kessler S C,Tiedeken E J,Simcock K L,et al.Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides [J].Nature,2015,521 (7550):74-85.

[6]Suchail S,Debrauwer L,Belzunces L P.Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera[J].Pest Manag Sci,2004,60(3):291-296.

[7]Singaravelan N,Inbar M,Ne'eman G,et al.The effects of nectar-nicotine on colony fitness of caged honeybees[J].J Chem Ecol, 2006,32(1):49-58.

[8]Casida J E.Neonicotinoid metabolism:compounds,substituents, pathways,enzymes,organisms,and relevance [J].J Agric Food Chem,2011,59(7):2923-2931.

[9]Tomizawa M,Casida J E.Neonicotinoid insecticide toxicology: Mechanisms of selective action[J].Annu Rev Pharmacol,2005,45: 247-268.

The effects of sucrose behavior responses on Apis cerana cerana by neonicotionid insecticides

Li Meng,He Jingfang,Li Zhiguo,Su Songkun

(College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

Neonicotinoid insecticides（neonicotinoids）are now the most widely used insecticides in the world.The neonicotinoid insecticide acts on the nicotinic acetylcholine receptors(nAChRs)of insects,releasing ach receptor inhibitor and preventing the conduction of neuro.Our study measured the LD50in 24 h of the Apis cerana cerana which exposure on the imidacloprid and clothianidin to assess the acute toxicity death of Apis cerana cerana.Then we made the Apis cerana cerana exposure on the insecticides sub-lethal dose,after 2 h、24 h、and 48 h.We collected the data of PER to explain the effect of neonicotinoid insecticides on the Apis cerana’s behaivour.

Apis cerana cerana，neonicotinoid insecticide，imidacloprid，clothianidin;proboscis extension response(PER)

国家现代蜂产业技术体系项目（CARS-45）

李梦（1990-），女，在读硕士，主要研究方向为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂健康的影响，E-mail：276360394@qq.com

苏松坤（1970-)，研究员，博士生导师，主要研究方向为蜜蜂科学，E-mail：365634176@qq.com