黑葡萄穗霉菌生防细菌LY424产天然红色素特性的研究

李紫嫣 杨慧慈 李龙飞 穆守臣 赵志龙 许俊杰 钟文文

摘要[目的]研究黑葡萄穗霉菌（Starchybotrys chartarum）生防细菌LY424产天然红色素的特性。[方法]培养菌株、提取色素，测定吸收峰和色素色价，探讨不同条件对红色素稳定性的影响。[结果]红色素的最大紫外吸收值在波长524 nm处；色素色价为6693；易溶于极性溶剂；酸碱度和温度对色素影响较小；易被强氧化剂氧化；金属离子对色素的影响不明显；保存该色素的条件为密封避光。 [结论]该红色素产量和稳定性较高，可以作为一种天然色素资源进行开发。

关键词天然红色素；色价；稳定性

中图分类号Q939.9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0051-03

Abstract[Objective] The basic characteristics of a LY424 bacterial strain which can prevent and control the growth of Starchybotrys chartarum to produce the natural red pigment were studied. [Method] To culture strain and extract pigment， determine absorption peak and color value and the influence of different conditions on the stability of red pigment. [Result] The maximum UV absorption value of the natural red pigment was at 524 nm， the color value was 66.93， the red pigment also dissolved in polar solvents very easily， its color could not be affected by pH， temperature and metal ions， easily oxidized by the strong oxidizer， at this time it was concluded that the pigment need to be kept under conditions of no light and air. [Conclusion] The red pigment has higher production and better stability， so can be used as a natural pigment resource for development.

Key wordsNatural red pigment；Color value；Stability

基金项目国家级大学生创新项目（201510452017，201610452041）。

作者简介李紫嫣（1996—），女，山东东营人，本科生，专业：制药工程。*通讯作者，讲师，从事微生物分离鉴定及生物农药研究。

收稿日期2016-12-19

目前，色素已广泛应用于日常生活及科学研究的各个领域。食品着色经历了这样的一个发展过程：天然色素—人工合成色素—天然色素与人工合成色素并用—更加安全稳定的天然食用色素[1]。随着医学毒理和生物学研究的不断深入，发现允许使用的人工合成色素中，大多数种类对人体有不同程度的伤害，尤其是致癌[2]、致畸、致突变，已引起人们的高度重视。因此，天然色素越来越受到人们的青睐[3]。与合成色素相比，天然色素具有无毒副作用、安全性高、有一定的营养价值和保健功能、着色比较自然、更接近于天然物质的颜色等特点。天然色素不仅广泛应用于饮料、酒类、糕点、糖果等饮料和食品当中[4]，也可应用于医药和化妆品生产，这便要求有广阔的色素来源。目前，对天然色素的研究主要集中在植物与微生物领域[5]。自然界中微生物能产生色素的种类非常丰富，通过微生物发酵生产色素[6]，不受资源、环境和空间的限制，是高效、低成本获得目标色素的有效途径。笔者通过研究黑葡萄穗霉菌（Starchybotrys chartarum）生防细菌LY424，探明该细菌菌株产红色素的基本特性及其稳定性，以期为进一步研究开发利用菌株资源打下良好基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。

黑葡萄穗霉菌生防细菌LY424细菌菌株[7]由临沂大学微生物重点实验室从土壤中分离保藏。

1.1.2供试培养基。

PDA培养基[7]。

1.1.3主要仪器。

TU-1810紫外可見光分光光度计，超净工作台，DS-1型高速离心机，恒温生化培养箱，电热水浴锅，高压灭菌锅，紫光灯。

1.2方法

1.2.1菌株的培养。

将菌种用划线法接到PDA培养基上，置于30 ℃恒温生化培养箱中培养24 h。

1.2.2色素的提取。

用无菌蒸馏水将菌体及其色素等从平板培养基上完全洗下，放烧杯内用DS-1型细胞破碎仪在12 000 r/min转速下破碎10 min，然后再用离心机，在4 ℃下以11 000 r/min反复离心洗涤除去菌体，留上部色素液。

1.2.3紫外光谱扫描。

将“1.2.2”所得色素液用TU-1810紫外可见光分光光度计扫描，并以灵菌红素纯品（由中国海洋大学医药学院提供）为对照，找出最大吸收波长[8]。

1.2.4红色素色价的测定。

取2 g的菌体及其代谢物混合体，加无菌蒸馏水以离心的方法反复洗脱胞外色素，得上部色素液后定容到50 mL，然后称菌体湿重，从2 g混合物中减去菌体重量后可得红色代谢产物的质量。以蒸馏水为参照测色素液在最大吸收峰处的吸光度，用公式计算色价[9]：

色素色价=吸光度×稀释倍数/质量

1.2.5色素稳定性的研究。

色素与有机溶剂的相溶性检测：取12支试管，在室温下分别加入3 mL的甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸、水、二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳、四氯甲烷、液体石蜡、甘油，然后给每支试管加入3 mL色素液，同时观察相溶性和颜色变化，以后隔不同的时间段测可溶溶液的吸光度，分析其色变情况。

不同pH溶液处理色素：取等量的色素液，分别用HCl和NaOH调节pH为2、4、6、8、10、12、14，观察色素色调变化，并分别测其吸光度。

不同温度下处理色素：取等量的色素液装入试管中，放室温以及40、60、80、100 ℃下在不同的时段观察色素的色调变化，并分别测其吸光度。

色素在不同金属盐离子溶液中的变化：取相同体积的色素液装入试管中，分别加入0.2 g的不同盐，观察当时溶液的变化，并分别测其吸光度，24 h后再测其吸光度，对比分析金属离子对色素的影响情况。

氧化还原剂对色素的影响：取80 mL色素液等量分装在8支试管中，依次编号为1、2、3、4、5、6、7和8，1～4号分别加入0.1、0.3、0.6、1.0 mL H2O2，5～8号分别加入0.05、0.10、0.20、0.40 g的Na2SO3，观察颜色变化，并分别测其吸光度。

可见光和紫外光对色素的影响：将装有色素液的试管放在可见光和紫外光下，分别在不同的时段观察其变化结果。

自然光下2种保存色素方法比较：取等量50 mL色素液分装在磨口瓶里，一只用紧塞不透气的橡胶塞，一只用可透过空气但可隔离细菌的透膜封口，在不同的时段测定吸光度。

2结果与分析

2.1紫外-可见光谱扫描分析

色素的紫外可见光扫描图谱见图1。由图1可知，该色素在波长524 nm处有最大吸收峰，说明该色素的分子结构具有很大的共轭体系，可能有很多共轭双键、苯环或类似苯环的共轭结构，或含杂原子的一些杂环，故在生态条件的研究中可测定色素溶液在波长524 nm处的吸收值来研究色素的产量，同时为下一步色素的鉴定提供一定的依据。

2.2色素的色价测定

通过称量计算得红色代谢物湿重为1.154 2 g，其稀释50倍后在最大吸收波长524 nm处的吸光度为1.545，带入公式计算得色素色价为66.93。

2.3与有机溶剂的相溶性

从表1看出，用甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸和水几类极性溶剂洗脱菌体后，溶液不分层，均表现可溶性或者易溶性，说明色素结构中含有极性基团。

用二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳和三氯甲烷洗脱菌体后，溶液出现分层现象，均表现不溶性。由此推知，色素化学结构中含有双键、羰基和醛基等极性基团。

2.5不同温度对色素的影响

从表3看出，该菌红色素在室温下，随着加热时间延长其OD524和残存率均有所变化，但变化幅度较小，说明红色素在室温下较为稳定；在40～60 ℃下处理时，其OD524和残存率变化不大，说明在该温度范围内色素保持良好的稳定性；在80 ℃下OD524和残存率变化幅度均较大，可知该温度下色素有部分降解现象，高温影响色素的稳定性；温度达到100 ℃时，OD524和残存率变化幅度进一步扩大，OD524小到1.572，残存率降低到55.24%。由此可知，该色素稳定性随温度的升高而降低。

2.6金属离子的影响

从表4看出，不加金属离子时原液均呈桃紅色，加入金属离子24 h后原液颜色发生不同变化，Na+溶液颜色不变，Fe3+溶液逐渐变成灰色，Mn2+溶液由桃红色变成紫红色，Ca2+、Mg2+两溶液由桃红色变成红色。由此可知，金属离子Fe3+ 和Mn2+加入原液后颜色变化较大，原因是它们具有较强的氧化性，而其他金属离子则无此特性，原因是它们均无氧化性。

2.7氧化还原剂对色素的影响

从表5吸光度及残存率看出，在原液中加入H2O2和Na2SO3，1～4号的吸光度均有所减小而且变化幅度较大，颜色由鲜红色逐步变成浅红色；加入Na2SO3的5～8号的吸光度亦有所减小且变化幅度较小，颜色由鲜红色变为桃红色，说明氧化剂对色素具有一定的降解作用。

2.8光照对色素的影响

从表6看出，可见光下随着时间的延长，色素的吸光度和残存率均逐渐减小，说明该色素在可见光下容易发生降解，其对光稳定性较差；在紫外光下，随着时间的延长色素吸光度和残存率均减小，说明紫外光对该色素亦有降解作用。

2.9色素的保存方法

从表7 看出，色素的吸光度和残存率随时间延长均逐渐减小，且减小幅度较大，说明暴露空气的情况下，色素因氧气存在而降解；在封闭条件下，残存率和OD524均减小，但减小幅度不大，说明封闭条件下有利于色素的稳定。

3结论与讨论

该色素在波长524 nm处有最大吸收峰，袁保红等[10]报道的色素最大吸收峰为534 nm，由此推测该色素的分子结构存在共轭体系，可能有很多共轭双键、苯环或类似苯环的共轭结构，或含杂原子的一些杂环。至于该色素的具体结构和影响结构稳定的基团有待于进一步测定。

参照国家色素测定标准[11]，经测定该菌株所产红色素色价为66.93，说明该色素产量较高，可以作为一种天然色素资源进行开发，前景较为广阔。

细菌LY424产生的红色素可以有效抑制黑葡萄穗霉菌的生长，因此该菌株还可以作为生防菌来研究开发，具有良好的应用前景。

pH对该菌红色素的稳定性有一定影响，在pH 2～6时颜色逐渐变成紫色，在pH 8～12时色素颜色逐渐变成淡红色。用甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸和水几类极性溶剂洗脱菌体后，均表现可溶性；用二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳和三氯甲烷洗脱菌体后，均表现不溶性。该菌红色素在室温下较为稳定；在40～60 ℃下处理时，色素保持良好稳定性；在80 ℃下色素有部分降解现象；温度达到100 ℃时色素稳定性较差。不加金属离子时原液均呈桃红色，加入金属离子Fe3+和Mn2+后颜色变化较大，原因是它们具有较强的氧化性，而其他金属离子对色素颜色影响不大。加入H2O2后，色素颜色逐渐变为无色；加入Na2SO3后，色素颜色无变化。该色素长期暴露空气时降解速度加快，因此在储藏时应密封保存。

参考文献

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