云南切梢小蠹热激蛋白40基因的克隆与序列分析

摘要[目的]克隆云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）热激蛋白40基因，并进行序列分析，得到该基因的特征。[方法]采用RACE克隆技术，获得云南切梢小蠹热激蛋白40基因，并对该基因进行分析。[结果]试验获得的基因序列长为1 205 bp，开放阅读框1173 bp，编码氨基酸序列390个，编码蛋白质的预测分子量为43.56 ku，等电点为7.35。该基因蛋白序列具有1个Amidation位点，2个天冬酰胺N末端糖基化位点，2个CAMP和CGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，3个酪蛋白激酶 Ⅱ 磷酸化位点，7个N末端十四烷基化位点，4个蛋白激酶C磷酸化位点，1个RGD细胞附着序列，1个DNAJ-1 结构域等热激蛋白40所具有的典型特征。[结论]通过同源性比对分析发现，云南切梢小蠹热激蛋白40基因与家蚕（Bombyx mori）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）和东亚飞蝗（Locusta migratoria）的热激蛋白40基因在氨基酸水平上一致性为20%～30%，它们的相似性均不高。虽然不同昆虫Hsp40在进化过程中具有高度的保守性，编码序列变异比较低，但是结构域差异与生物体适应外界环境有一定的关系。

关键词云南切梢小蠹；热激蛋白40；序列分析

中图分类号S763.38文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0147-04

Abstract[Objective]To clone the gene of heat shock protein 40 in Tomicus yunnanensis and get the gene characteristics by sequence analysis.[Method]The gene of heat shock protein 40 in T.yunnanensis was obtained and analyzed by using rapid amplification of cDNA ends （RACE） method. [Result]This gene was 1 205 bp in length with opening reading frame （ORF） of 1 173 bp. The deduced amino acid sequence of T.yunnanensis Hsp40 revealed a protein of 390 amino acids.Its predicted molecular weight and isoelectric point were 43.56 ku and 7.35. It has several conservation amino acid sites including one Amidation site， two Nglycosylation sites， two CAMP and CGMP dependent protein kinase phosphorylation sites， three Casein kinase II phosphorylation sites， seven Nmyristoylation sites， four Protein kinase C phosphorylation sites， one RGD Cell attachment sequence， and one DNAJ1 Cell attachment sequence.[Conclusion]It shared 20%-30% amino acid identity with the Hsp40 of Bombyx mori，Tribolium castaneum，Liriomyza sativae and Locusta migratoria.Their similarity is not high. Although the Hsp40 of different insects is highly conserved in the evolution process， the variation of the coding sequence is relatively low， but there has a certain relationship between the structural domain differences and the organism that adapting to the external environment.

Key wordsTomicus yunnanensis；Heat shock protein 40；Sequence analysis

基金項目云南省林学一级学科博士点建设项目。

作者简介樊晓红（1989—），女，云南楚雄人，硕士研究生，研究方向：森林昆虫学。

收稿日期2016-12-31

热激蛋白（Heat shock proteins，Hsp）又称热休克蛋白或应激蛋白，是细胞或生物体受到胁迫后合成的一类高度保守的蛋白质。热激蛋白作为细胞的重要组成成分，几乎在所有的生物体都有存在。昆虫体内的Hsps在受到各种因素（如高温、低温、干燥、缺氧、杀虫剂、重金属、饥饿等）的刺激下，均可通过自身基因表达的改变，使机体热激蛋白物质合成增多。根据序列相似性和蛋白分子量大小，可以将热激蛋白超基因家族分为Hsp110、Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10和sHsp等8个家族，其中分子量在15 ku～30 ku的Hsp称为小分子热激蛋白（small heat shock protein，sHsp）[1-3]。Hsp广泛存在于各种生物体内，对生物个体的生长、发育和生存发挥着重要的角色[4-5]。无论如何进化，Hsp均具有2个特征，一是分子结构有很高的同源性；二是大多存在异构体，这是因为磷酸化、甲基化、糖基化、ADP、核进化等作用，导致Hsp异构体的形成，变构作用能影响Hsp的功能与代谢的稳定性[6]。同时，它还具有分子伴侣、抗氧化、协同免疫、抗细胞凋亡、调节激素受体和某些蛋白激酶的特性。

热休克蛋白40，即Hsp40是跨物种存在的高度保守的蛋白质家族。在细胞应激保护、蛋白质折叠、重折叠或聚集与降解、蛋白质移位以及分子伴侶等方面有重要作用。研究表明，Hsp40蛋白在生物体正常及热激、盐、重金属、毒物代谢等胁迫下参与蛋白质的折叠、转运、分泌和目标蛋白的降解等作用[7-9]。Hsp40能够通过调节Hsp40/Hsp70的ATPase活性，使得Hsp70结合的底物多肽发生折叠，促进部分变性的蛋白复性（重新折叠）来保护胁迫损害的细胞并使其恢复正常功能[10-11]。除此之外，Hsp40的结构域DNA J能激活DnaK的ATP酶活性，从而帮助宿主细胞的λDNA进行复制，也能参与维持蛋白质结构的稳定和变性蛋白的复性作用[12-14]。因此，Hsp40是一种与细胞多种生命活动密切相关的重要蛋白质[15]。

云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）属于鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹属（Tomicus）。它是一种严重为害松属树种的危险性蛀干害虫，是云南省补充植物检疫对象。在云南主要为害云南松、思茅松、华山松、高山松等，特别是对云南松的为害最为严重。云南切梢小蠹已对全省松属植物安全构成了严重威胁[16]。防治蠹害，保护云南松林，对于云南以及长江中上游地区的生态和经济建设以及可持续发展具有重要的意义[17]。目前，对于云南切梢小蠹的研究主要集中在种群生态、驱避性、危害习性、生物学特性、寄主选择性、抗病性、趋性及信息素诱导等。对膜翅目昆虫体内热激蛋白的研究已经被报道，如黑腹果蝇热激蛋白，共有Hsp90、Hsp70、Hsp40、sHsp、Hsp60、TRiC等6个基因家族，不存在Hsp10和Hsp110家族[18]。但是对云南切梢小蠹体内热激蛋白的功能研究少有报道。因此，研究云南切梢小蠹热激蛋白40具有重要意义。

该研究通过对云南切梢小蠹热激蛋白40基因克隆与序列分析，利用生物信息学方法，进行蛋白序列分析、系统发育分析等，除了阐明Hsp40的结构和功能外，还有助于揭示昆虫热激蛋白与环境信息作用的机制，为探索新的害虫防治途径提供理论依据，并为后续研究该热激蛋白各基因家族生理功能提供参考依据。

1材料与方法

1.1供试昆虫

将云南松有虫孔的树枝或树干，用大刀或斧头劈开，采集云南切梢小蠧幼虫。

1.2主要试剂和药品

总RNA提取所用的TRIzol Reagent购于Invitrogen公司，Advantage 2 PCR kit（Clontech）购于Takara公司，pGEM-T-easy载体购于Promega公司，阳性克隆送南京金思特公司测序。

1.3总RNA的提取及cDNA第一条链合成

挑取云南切梢小蠹5头，提取其总RNA，提取过程依照TRIzol试剂盒（Invitrogen）说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度，将总RNA保存于-80 ℃备用。cDNA第一条链的合成按Advantage 2 PCR kit试剂盒（TaKaRa）说明书进行，将第一条链cDNA保存于-20 ℃备用。

1.4PCR扩增

以第一条链cDNA作为模板，利用合成的引物进行PCR反应。扩增体系为25 μL，其中包含2 μL cDNA模板。扩增条件：94 ℃预变性3 min；然后94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环40次；72 ℃延伸10 min。

1.5PCR产物的克隆与测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带经切胶回收纯化，然后连接到pGEM-T-easy载体，并转化到感受态细胞中，进行蓝白斑筛选以及质粒PCR鉴定后选取阳性克隆送南京金思特公司测序。

1.6序列分析

核苷酸序列的翻译和氨基酸序列的比对分析分别使用Genetyx；通过NCBI网站，对序列进行BlastX比对分析，下载蛋白质序列，利用ClustalX 1.83软件进行多序列比对；对蛋白信号肽的预测使用SignalP分析，结构域预测采用Motifscan分析。

45卷5期樊晓红云南切梢小蠹热激蛋白40基因的克隆与序列分析

2结果与分析

2.1cDNA克隆及序列分析

克隆获得的Hsp40基因cDNA长度为1 205 bp，翻译的起始密码子为26位的ATG，终止密码子AAT位于1 198位，开放读框长1 173 bp（图1）。该基因编码390个氨基酸，预测分子量和等电点分别为43.56 ku和7.35，SignalP预测该蛋白不具信号肽，Motifscan分析发现，其氨基酸序列中潜在1个Amidation位点（Amidation site）（KGKK198-201），2个天冬酰胺N末端糖基化位点（Nglycosylation site）（NCSL115-118和NLTE266-269），2个CAMP和CGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点（CAMP and CGMP dependent protein kinase phosphorylation site）（RRCS178-181和RKGS245-257），3个酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化位点（Casein SSDD373-376），7个N末端十四烷基化位点（Nmyristoylation site）（GIKEGG71-76、GGGGGM77-82、GGGGSR96-101、GAGGAK142-147、GMKDGD216-221、GLEPGD234-239、GGPQGV380-385），4个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation site）（TKK126-128、SCK196-198、TRK253-255和SRK334-336），1个RGD细胞附着序列（RGD Cell attachment sequence）（RGD318-320），1个DNAJ-1结构域（DNAJ-1 Cell attachment sequence）（FKLISDAYEVLSDPKKREVY45-64）。

2.2同源性比较

用ClustalX 1.83对Hsp40与其他昆虫Hsp40的氨基酸序列比对结果见图2。从圖2可以看出，云南切梢小蠹Hsp40与其他昆虫Hsp40的相似性不是很高，其中与家蚕（Bombyx mori）、 赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）、 东亚飞蝗（Locusta migratoria）的相似度分别为25%、28%、27%和26%。

3结论与讨论

Hsps家族成员在原核生物与真核生物中普遍存在，进化程度相对保守。在生理状态下，Hsps多数作为分子伴侣，帮助蛋白质的正确折叠、移位、维持降解。当机体受到理化因素或者各种生物因素刺激时，Hsps的表达量往往会大幅度提升，参与细胞结构维持、更新、修复、免疫等诸多环节，以提高细胞抵抗外来刺激的能力[19]。鉴于其免疫保护作用，热激蛋白家族一直是热门的研究对象[20]。

Hsp40首先在原核细胞中被发现，由2个结构域和C端的DNA J-C结构域构成。DNA J结构域高度保守，在蛋白质翻译、折叠、去折叠、转移和降解中扮演着重要的角色，其作用是激活Hsp70 C端EEVD基序的ATP酶活性。Hsp40基因沉默可能会降低Dna K/Hsp 70蛋白的活性，进而无法及时促进变性蛋白的复性[21-22]。当机体受到胁迫损害时，细胞损伤不能被及时修复，降低害虫应对外界胁迫时产生的蛋白修复能力，从而达到控制害虫的目的。DNA J家族也被称为J蛋白家族，DNA J家族成员HSPA/DNA K蛋白协作，促进ATP向ADP的水解，从而帮助Hsp70伴侣蛋白锁定其所结合的蛋白质底物，形成三聚体预防未折叠底物的聚集[20]。DNA J结构域大小为70个氨基酸，由1个环区和4个螺旋构成，环区位于第2、3螺旋之间，有1个高度保守的HPD基序[23]。除以上保守区域外，DNA J家族成员还含有其他决定着DNA J蛋白功能差异的结构域，如哺乳动物细胞中的DNA J蛋白ERdj5/JPDl具有类二硫键异构酶功能域，能够促进内质网蛋白形成二硫键[24-25]。

该研究利用RACE技术，从云南切梢小蠹基因库中克隆获得1个Hsp40全长基因。云南切梢小蠹Hsp40与家蚕、赤拟谷盗、美洲斑潜蝇、东亚飞蝗Hsp40氨基酸序列的一致性分别为25%、28%、27%和26%，可以看出它们的相似性均不高，编码氨基酸序列有多个保守的氨基酸位点，这体现了不同昆虫Hsp40在进化过程中具有高度的保守性。尽管热激蛋白序列保守，编码序列变异比较低，但近期已有研究表明，热激蛋白基因序列变异，而且这类变异与生物体对逆境胁迫的适应间存在着一定的相关。该试验利用Motifscan分析云南切梢小蠹Hsp40发现，其氨基酸序列中潜在1个DNA J-1结构域（DNA J1 Cell attachment sequence），这与李云华等[26]的研究相一致，而且进一步证实了热激蛋白在进化上具有高度的保守性。此次研究云南切梢小蠹与热激蛋白40的作用机制，可以通过改变或者调控一些作用因子，从而寻找到控制蛀干害虫的新方法，为今后的害虫防治提供理论基础和新途径。

参考文献

[1] KIM K K，KIM R，KIM S.Crystal structure of a small heatshock protein[J].Nature，1998，394（6693）：595-599.

[2] FEDER M E，HOFMANN G E.Heatshock proteins，molecular chaperones，and the stress response：Evolutionary and ecological physiology[J].Annual review of physiology，1999，61（1）：243-282.

[3] SRENSEN J G，KRISTENSEN T N，LOESCHCKE V.The evolutionary and ecological role of heat shock proteins[J].Ecology letters，2003，6（11）：1025-1037.

[4] DAI L L，PENG D L，HUANG W K，et al.Cloning and sequence analysis of three new heat shock protein 90 gene（hsp 90）from Bursaphelenchus xylophilus，B.mucronatus and B.doui[J].Journal of agricultural biotechnology，2011，19（5）：916-923.

[5] 郭文丽.热激蛋白在作物抗逆境胁迫中的研究进展[J].教育教学论坛，2010（6）：142.

[6] 靳远祥，陈玉银.热休克蛋白的研究进展及其应用[J].科技通报，2002，18（2）：157-163.

[7] 周人纲，MIERNYK J A.拟南芥AtJ3基因的克隆和分析[J].植物学报，1999，41（6）：597-602.

[8] ZHU J K，SHI J，BRESSAN R A，et al.Expression of an Atriplex nummularia gene encoding a protein homologous to the bacterial molecular chaperone DnaJ[J].The plant cell，1993，5（3）：341-349.

[9] 柴团耀，张玉秀，赵文明.DnaJ-like蛋白cDNA的克隆及其在重金属胁迫下的表达研究[J].自然科学进展，2000，10（2）：135-140.

[10] GLOVER J R，LINDQUIST S.Hsp104，Hsp70，and Hsp40：A novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins[J].Cell，1998，94（1）：73-82.

[11] MACARIO A J，DE MACARIO E C.The archaeal molecular chaperone machine：Peculiarities and paradoxes [J].Genetics，1999，152（4）：1277-1283.

[12] YOCHEM J，UCHIDA H，SUNSHINE M，et al.Genetic analysis of two genes， dnaJ and dnaK，necessary for Escherichia coli and bacteriophage lambda DNA replication[J].Molecular and general genetics，1978，164（1）：9-14.

[13] LINDQUIST S，CRAIG E A.The heatshock proteins [J].Annual review genetics，1988，22：631-677.

[14] QIU X B，SHAO Y M，MIAO S，et al.The diversity of the Dna J/Hsp40 family，the crucial partners for Hsp70 chaperones[J].Cell molecule life science，2006，63（22）：2560-2570.

[15] WEBERBAN E U，REID B G，MIRANKER A D，et al.Global unfolding of a substrate protein by the Hsp100 chaperone ClpA [J].Nature，1999，401（6748）：90-93.

[16] KIRKENDALL L R，FACCOLI M，YE H.Description of the Yunnan shoot borer，Tomicus yunnanensis Kirkendall & Faccoli sp.n.（Curculionidae，Scolytinae）an unusually aggressive pine shoot beetle from southern China，with a key to the species of Tomicus[J].Zootaxa，2008，1819：25-39.

[17] 〖JP4〗廖周瑜.纵坑切梢小蠹伴生菌——云南半帚孢（Leptographium yunnanense）危害机理与云南松抗性研究[D].昆明：云南大学，2002：1-2.

[18] 牟国鹏，陈斌，何正波.黑腹果蝇热激蛋白基因家族的生物信息学分析[J].重庆师范大学学报（自然科学版），2011，28（3）：10-17.

[19] MULTHOFF G.Heat shock protein 70（Hsp70）：Membrane location，export and immunological relevance[J].Methods，2007，43（3）：229-237.

[20] WALSH P，BURSAC〖DD（-1〗〖HT8.〗'〖DD）〗 D，LAW Y C，et al.The Jprotein family：Modulating protein assembly，disassembly and translocation[J].EMBO Reports，2004，5（6）：567-571.

[21] CORSI A K，SCHEKMAN R.The lumenal domain of Sec63p stimulates the ATPase activity of BiP and mediates BiP recruitment to the translocon in Saccharomyces cerevisiae[J].The journal cell biology，1997，137（7）：1483-1493.

[22] NOVER L，SCHARF K D.Heat stress proteins and transcription factors[J].Cellular and molecular life sciences，1997，53（1）：80-103.

[23] QIAN Y Q，PATEL D，HARTL F U，et al.Nuclear magnetic resonance solution structure of the human Hsp40（HDJ1）Jdomain[J].Journal of molecular biology，1996，260（2）：224-235.

[24] CUNNEA P M，MIRANDAVIZUETE A，BERTOLI G，et al.ERdj5，an endoplasmic reticulum（ER）resident protein containing DnaJ and thioredoxin domains，is expressed in secretory cells or following ER stress[J].The journal biology chemistry，2003，278（2）：1059-1066.

[25] HOSODA A，KIMATA Y，TSURU A，et al.JPDI，a novel endoplasmic reticulumresident protein containing both a BiPinteracting Jdomain and thioredoxinlike motifs[J].The journal of biology chemistry，2003，278（4）：2669-2676.

[26] 李云華，朱诗应，孙庆文，等.中华按蚊热激蛋白40（HSP40）cDNA序列的全长扩增[J].国际医学寄生虫病杂志，2012，37（3）：133-134.