基于GBS技术的中华绒螯蟹的遗传特征分析

高祥刚　鲍相渤　高美玲

摘要[目的] 研究中华绒螯蟹经过多年的人工养殖、跨流域引种和增殖放流等活动可能会对其遗传特性造成的影响。[方法] 基于下一代GBS测序技术，利用SNP标记对辽河家系、辽河野生、长江群体、海南群体、黄河群体进行遗传特征分析。[结果] 经过条件为测序深度4×、Miss0.5、次要等位基因频率（MAF）>0.05 的过滤后，共获得 652 746个高质量的 SNP 位点用于群体的遗传分析，各群体平均观测杂合度（Ho）为0.084 4～0.124 9，平均期望杂合度（He）为0.097 4～0.200 3，群体平均π值（Pi）为0.158 3～0.254 4，群体Fi的平均测量值（Fis）为0.054 2～0.238 43。两两群体间遗传分化指数 Fst值结合系统发生树，可以看出，长江群体与海南群体的遗传距离较近，分化较小，表示海南的中华绒螯蟹苗种可能来自长江流域。[结论] 该研究揭示了不同水系中华绒螯蟹的遗传差异，探讨了其遗传多样性水平，为中华绒鳌蟹资源的合理开发利用与保护提供理论依据。

关键词中华绒螯蟹； GBS；SNP；遗传多样性；种群结构

中图分类号S917.4文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）36-0080-03

Abstract[Objective] To assess the genetic diversity and population structure of the wild and cultured E.sinensis populations （i.e.）. [Method] Based on GenotypingbySequencing technology，genetic character of Liaohe pondreared population （LC），Liaohe wild population （LW），Changjiang pondreared population （CJ），Hainan pondreared population （HN），Huanghe pondreared population （HH） was analyzed by using SNP marker.[Result] After screening with parameter of dp4，miss0.5 and minor alleles frequency （MAF）>0.05，a total of high quality 652 746 SNP sites were retained to analyze genetic character of population.The mean observed heterozygosity （Ho） was from 0.084 4 to 0.124 9，the mean expected heterozygosity （He） was from 0.097 4 to 0.200 3，the mean nucleotide diversity （Pi） was from 0.158 3 to 0.254 4，the average pairwise inbreeding coefficient Fis ranged from 0.054 2 to 0.238 43.Both the Fstatistic （Fst） among populations and phylogenetic analysis suggested that the CJ population had a very close relationship with HN population.It may indicate that the baby crabs of Hainan Province derived from Changjiang river.[Conclusion] The information may be beneficial for biodiversity conservation and management of E.sinensis.

Key wordsEriocheir sinensis； GBS；SNP； genetic diversity；population structure

中華绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹、毛蟹，在动物分类地位上隶属于节肢动物门甲壳纲十足目爬行亚目方蟹科绒螯蟹属[1-2] ，属高等甲壳动物。该蟹广泛分布于辽河、黄河、长江、瓯江和闽江等我国沿海各大水系，其肉味鲜美，营养丰富[3]。自 20 世纪 80 年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，目前已成为水产养殖支柱产业之一[4]。经过多年的人工养殖、跨流域引种和增殖放流等生产活动，已造成不同水系种质资源严重混杂[5-6]。因此，为深入了解该蟹不同地理群体的种质差异和遗传特征，更有效保护和管理利用中华绒螯蟹资源，对不同地理群体中华绒螯蟹的遗传多样性和群体遗传结构研究势在必行。

近年来，随着高通量测序技术的发展，基因分型的成本持续降低，GBS（Genotyping-by-sequencing） 技术作为第2代深度测序基础上发展起来的简化基因组测序技术，通过采用酶切加标签的方法，使多样本高通量平行测序得以实现。这不仅大大降低了基因测序的成本，也使对大样本全基因组的基因分型成为可能，对深入了解种质资源的遗传背景和系统演化具有重要意义[7]。同时， GBS 获得的短读序列可通过有参或无参基因组的形式进行拼接组装，进而获得高密度的 SNP 标记，利用这些 SNP标记可进行遗传图谱构建、加密，基因组的辅助组装，全基因组关联分析等相关研究。目前，GBS 技术作为基因分型的重要手段，已经在遗传多样性研究、遗传图谱构建、种质鉴定及品种识别等领域得到广泛的应用[7-10]。

采用GBS测序技术对中华绒螯蟹5个群体的遗传多样性及遗传结构展开研究，以揭示不同中华绒螯蟹地理群体的遗传差异，探讨其遗传多样性水平，为该蟹种质资源的合理开发利用与有效保护提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验分析的群体为5个，均为（2龄）发育成熟个体，分别是取自盘锦辽河口的野生中华绒螯蟹群体、培育的辽河家系群体、采集自长江南通的养殖群体、采自黄河口附近东营的养殖群体，以及购买自海口海鲜市场的海南养殖群体（表1）。解剖出体壁肌肉保存于-40 ℃冰箱备用。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取和 GBS文库构建。

对采集的肌肉组织样品，利用天根生化科技（北京）有限公司的基因组 DNA 提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA。使用紫外分光光度计（Nanodrop，Thermo Scientific），在 260和280 nm 处分别测定 DNA 的吸光值，并通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。

提取的样品 DNA 送上海派森诺生物科技股份有限公司进行 DNA 质检、建库和测序，采用限制性内切酶（HindⅢ+Bfal）对全基因组 DNA 进行完全酶切，回收插入片段大小在220～450 bp 之间的酶切片段，按照 Double Digest Genotyping-by-Sequencing （dd-GBS） 的方式进行建库，利用第2代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina Hiseq测序平台，对文库进行双末端（Paired-end，PE）150 bp的测序。

1.2.2单核苷酸多态性（SNP）鉴定，

每条测序数据按照条码划分到对应的样本中，对每条序列进行严格的质控筛选，去除原始测序序列中的接头序列和低质量的短读序列，包括单端测序中含有的 N 数量超过该条序列长度的 10%，或者单端测序中低质量（Q≤5）碱基数超过该条序列长度 50%的序列。SNP 检测采用 Samtools 软件进行，对齐的匹配文件用 Samtools 软件转换为 BAM 文件后进行变异调用，Samtools 收集 BAM 文件中的汇总信息，计算可能基因型的似然值，再利用 Bcftools 应用先验值进行变异调用，采用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点获得 VCFs 文件。

1.2.3遗传数据分析。对5个群体的样本，采用 stacks 程序包中的 populations 命令进行群体遗传多样性各参数、Fst值计算，分析各群体的遗传多样性水平、群体间的遗传分化程度[11-12]。采用 FastTree 软件中的 ML 算法，利用P-distance 计算样品间的遗传距离，并构建系统发育树。建树完成后，对系统发育树分支的可靠性进行验证（bootstrap， 1000 replications）。

2结果与分析

2.1测序质量GBS 测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，24个中华绒螯蟹样本的总测序数据量为44.7 Gb，去除低质量的序列后，产生的高质量序列数据量为 38.5 Gb，平均每个样本数据量为 1 604 Mb。测序质量较高（Q20≥94.67%，Q30≥85.38%），GC 分布正常，測序的峰值在Q40左右，测序质量较高。经过条件为测序深度4×、Miss0.5、次要等位基因频率（MAF）>0.05 的过滤后，最后共获得 652 746个高质量的 SNP 位点用于群体的遗传分析。

2.2群体遗传多样性分析

采用 stacks 程序包获得各群体的遗传多样性结果，辽河家系、辽河野生、长江群体、海南群体、黄河群体的平均观测杂合度（Ho）分别为：0.109 6、0.122 2、0.084 4、0.124 9、0.110 5，平均期望杂合度（He）分别为：0.145 0、0.097 4、0.172 5、0.190 7、0.200 3，群体平均π值（Pi）分别为：0.191 1、0.158 3、0.203 8、0.241 3、0.254 4，群体Fi的平均测量值（Fis）分别是：0.125 9、0.054 2、0.234 8、0.193 7、0.238 4（表2）。

2.3群体遗传结构分析

两两群体间遗传分化指数 Fst 值显示，辽河家系与辽河野生群体之间的Fst 值较大，长江群体与海南群体之间的Fst 值较小。各群体间的Fst 值差异不显著，为0.134 375～0.278 688。由ML 系统发生树（图1）可以看出，辽河家系首先和辽河的野生中华绒螯蟹群体聚在一起，长江群体和海南群体聚在一起，最后这4个群体再与黄河群体聚在一起。

3结论与讨论

基于GBS技术的辽河家系、辽河野生、长江群体、海南群体、黄河群体5个群体的SNP遗传多样性，其Ho为0.084 4～0.124 9， He为0.097 4～0.200 3， Pi为0.158 3～0.254 4。而闫龙等[6] 利用线粒体D_Loop控制区基因对取自盘锦、丹东、南京、垦利的野生群体的遗传多样性分析，表明其Pi在0.010～0.019，其遗传多样性处于较高的水平；刘青等[13]采用微卫星标记分析取自长江、辽河、黄河的6个中华绒螯蟹群体遗传水平，均表现出较高的遗传杂合度水平（Ho=0.702～0.744）；熊良伟等[14] 利用微卫星标记分析中华绒螯蟹兴化、盘锦、宣城养殖群体的遗传水平，发现其Ho为 0.70～0.75； He为 0.87～0.90，该蟹养殖群体也具有较高的遗传多样性水平。该研究与闫龙等[6]相比，群体平均π值（Pi）要高一个数量级，与刘青等[13]、熊良伟等[14]的微卫星分析结果相比，则遗传多样性水平要低很多，而产生这样的分析结果可能是分析方法不同造成的，该研究采用的第2代高通量测序技术，产生的数据能更真实，误差更小。

当群体内观测杂合度小于期望杂合度，同时 Fis 为正值，则表示群体内近交程度较为严重[15]，该研究的 5个群体的 Fis均为正值，除辽河野生群体的Ho>He，其他群体的Ho群体的遗传分化值数（Fst）能揭示种群间的遗传分化程度，Fst 值为0～0.05，群体的遗传分化较弱；Fst 值为0.05～0.15时，遗传分化水平中等；Fst 值大于 0.15 时，遗传分化较大[16]。该研究的几个群体间，除了长江群体与海南群体、黄河群体的 Fst值分别为：0.134 375、0.139 275，小于0.15，说明长江群体与这2个群间的遗传分化较小；其余群体间的Fst 值均大于 0.15，说明各群间的遗传分化较大。闫龙等[6]基于线粒体控制区对4个野生群体的遗传多样性分析，两两群体间遗传分化指数 Fst值显示在0.020 00～0.129 09。熊良伟等[14]对4个中华绒螯蟹群体在 10 个微卫星位点上平

均配对遗传分化系数统计量 Fst介于 0.012 3～0.020 7，处于低等程度分化，该研究与它们相比，遗传分化较高。结合图1的系统发生树，可以看出，长江群体与海南群体的遗传距离较近，分化较小，表明海南的中华绒螯蟹苗种可能来自长江流域。黄河口收集的中华绒螯蟹养殖群体与长江流域的群体遗传分化也较近，表示其苗种有可能来自南方。Sui等[17] 和Chang等[18]运用微卫星对中华绒螯蟹群体遗传学度研究表明，辽河水系与黄河水系、长江水系中华绒螯蟹群体之间存在较显著的遗传差异，而黄河水系与长江水系中华绒螯蟹群体间遗传差异不明显，该研究结果与上述研究结果相近。

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