家兔Myh7基因生物信息学分析及表达规律研究

赵斌 李挺 赵博昊 穆琳 胡帅帅 陈阳 吴信生

摘要[目的]对家兔Myh7基因进行生物信息学分析及表达规律研究。[方法]利用RT-PCR技术检测了Myh7在肌肉发育过程中的表达规律，并结合生物信息学方法对家兔Myh7的序列进行深入分析。[结果]Myh7蛋白为不稳定亲水性蛋白，有Myosin_N和MYSc_class_II这2个结构区域，其中MYSc_class_II是肌球蛋白重链家族特有结构域。MEGA软件分析家兔Myh7分子进化，发现其与人、猩猩等物种间同源性较高，与其亲缘关系的远近一致。定量分析显示：在整个肌肉发育过程中，Mhy7表达量在腿肌中基本维持在较低水平，在背肌中的表达量相对波动较大，而在11周龄时出现表达量上升的趋势。[结论]该研究为进一步研究Myh7基因在肌肉生长过程中的功能奠定了分子基础，为研究家兔的肌肉发育分子机制提供了一定的参考依据。

关键词兔；肌肉；Mhy7基因；生物信息学分析；表达规律

中图分类号S829.1文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）16-0130-03

Bioinformatics Analysis and Expression Characteristics of Myh7 Gene in Rabbit

ZHAO Bin，LI Ting，ZHAO Bohao，WU Xinsheng* et al（

Jiangsu Key Laboratory of Animal Genetics & Breeding and Mdecular Designing，College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract[Objective]Bioinformatics analysis and expnession characteristics of Myh7 gene in rabbit were studied.[Method]The expression characteristics of Myh7 was detected by RTPCR technique in the process of muscle development，and we further used bioinformatics methods to analyze rabbit Myh7 sequence.[Result]Myh7 protein was unstable and hydrophilic，with the Myosin_N and MYSc_class_II structure domain，MYSc_class_II was the special structure domain of myosin heavy chain.We used MEGA software to analyze Myh7 molecular evolution of rabbit，the result showed that homology was high among rabbit，human and orangutan，which was conforming to the kinship.Quantitative analysis showed that Mhy7 in leg muscle expressed in the low level，and the expression was fluctuant in the back muscle，increased in 11th week old rabbit.[Conclusion] The study provided the molecular basis for exploring the Myh7 gene function in the process of muscle growth，and it could also provide certain reference basis for studying the molecular mechanism of rabbit muscle development.

Key wordsRabbit；Muscle；Mhy7 gene；Bioinformatics analysis；Expression characteristics

兔肉是一種具有高营养价值的肉类，其含有高氨基酸、高卵磷脂、高蛋白和低胆固醇等，在心脑血管病、肝病、糖尿病患者中较受欢迎。肌肉发育过程影响着兔肉的产量和质量，肌肉发育包含胚胎期肌纤维的形成、肌纤维的发育和成年期肌肉的再生等，此发育过程受到许多基因的相关调控。目前，在人和小鼠上已发现在成肌定向分化早期，Myf5基因和MyoD基因起着关键作用[1]；肌肉干细胞最终分化为肌管肌纤维的能力与Mrf4基因和MyoG基因调控密切相关[2]，这些基因都属于成肌调节因子基因家族。除此之外，肌细胞增强因子基因家族、Wnt基因家族也是能直接调控肌肉发育的一类家族基因[3-4]。笔者所在课题组前期通过Agilent兔全基因组表达谱芯片技术筛选出肌肉中具有差异表达的基因，在这些差异表达的基因中，发现Myh7基因与新西兰白兔肌肉的生長发育密切相关。该研究利用生物信息学分析方法，对Myh7基因的理化性质和进化进行了分析和预测，同时利用RT-PCR方法检测不同部位不同时期肌肉中Myh7基因的表达规律，旨在探究Myh7基因在肌肉发育过程中作用，为研究家兔的肌肉发育分子机制提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂采集1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23周龄新西兰白兔背部和腿部肌肉，公母各1/2，分别取0.5 g 置于无酶管中，液氮冻存带回实验室-70 ℃保存备用。

荧光定量试剂盒（CW0956A）、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒（CW0741A）等购自北京康为世纪生物科技有限公司；上海生工生物工程有限公司提供DNA marker系列、无水乙醇等常规试剂；RNAstore样本保存液购自TIANGEN公司。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析。

蛋白的氨基酸序列组成等理化性质采用ProtParam软件进行分析，基因编码蛋白质的性质通过ExPASy工具对进行分析，运用NCBI的CDD软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测Myh7蛋白结构域；氨基酸序列的亲水性分析通过ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）进行，运用MEGA软件分析Myh7蛋白分子进化；运用TMPRED（http：//www.ch.embnet.org/software/）分析预测蛋白质的二级结构，运用PSORT II Prediction（http：//www.psort.org/）对Myh7的亚细胞定位进行预测分析。

1.2.2总RNA提取及cDNA 合成。

用传统 Trizol 法提取样品的总RNA，分光光度计测定总 RNA 的纯度和浓度，立即对提取后的总RNA进行反转录。取0.5 mL Ependorf 管，以总RNA 提取液2 μg为模板， oligo d（T）为反转录引物，在反转录酶 M-M LVRT 作用下进行反转录，反应体系为25 μL。

1.2.3RT-PCR法对Mhy7基因表达差异进行检测。根据已报道的Mhy7基因cDNA 部分序列设计引物，该引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息见表1。北京康为世纪生物科技有限公司提供荧光定量PCR预混体系，表达水平以GAPDH基因作为内参进行均一化处理。

2结果与分析

2.1家兔Mhy7的生物信息学分析

2.1.1家兔Mhy7蛋白理化性质分析。

根据 GenBank 上已发表的家兔的Myh7基因序列可知，家兔的Myh7基因全长20 869 bp。其中，编码序列由5 808个碱基组成，编码1 935个氨基酸残基，是一个较为保守的基因。经ProtParam在线软件预测，分子式为C9 722H15 810N2 772O3 090S66，原子总数为31 460个，分子量为223 087.1 ku，理论等电点为5.61。在所有编码氨基酸中，Glu （E）含量最高，为13.2%，Trp （W） 只占0.5%（表2）。带负电荷残基的总数量（ASP + Glu）：359，带正电荷残基的总数量（Arg+Lys）：315，不稳定指数是47.38，说明这个蛋白质不稳定。

由图1可知，Myh7蛋白疏水性最小值为-3.111，最大值为2.189。其主要亲水平均数（GRAVY）值是-0.421，因此Myh7蛋白为亲水蛋白。Myh7主要分布在细胞核（69.6 %）中，少量定位在细胞质中（17.4 %），说明Myh7主要在细胞核中发挥生物学作用。

2.1.2家兔Myh7蛋白的分子进化分析。

將人、猪、牛、羊、马、猩猩、猫、狗、小鼠、鸡的Myh7基因编码蛋白及兔Myh7蛋白序列调入MEGA中，进行系统进化分析。由图2可知，进化树总体分为两支，家禽鸡本身独立成为一支，其余的10个物种成立为一个独立大分支，而家兔Myh7基因与人、猩猩Myh7基因的分子进化距离最近，亲缘关系最近。

2.1.3家兔Mhy7保守結构域预测分析。

1 935个氨基酸由家兔Mhy7基因的CDS区编码，利用NCBI在线工具CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）进行保守结构域分析，结果显示：Myh7蛋白有2个特殊的区域，N端34～75 aa区段为Myosin_N结构域，79～799 aa区段为MYSc_class_II结构域。其中N端的Myosin_N区是肌凝蛋白SH3样结构域，而MYSc_class_II区由2个重链组成，头和尾域的卷曲螺旋把2个重链结合在一起，它有ATP的结合位点和P环结构（图3）。

2.1.4家兔Mhy7蛋白结构预测分析。

对蛋白质二级结构进行预测分析有助于认识蛋白质的空间结构，因为二级结构主要是多肽链主链骨架中局部的构象[5]。使用TMPRED和Swiss-Model软件分别对家兔Myh7的二级和三级结构进行预测。预测发现Myh7蛋白二级结构以α-螺旋为主，其中α螺旋（h）74.94%，无规卷曲（c）19.17%，延伸链（e）5.89%；而Myh7蛋白三级结构由2条互相交织程度不明显、较为简单且长度不等的螺旋链组成，呈现出链状分布，该蛋白与二级结构预测结果基本一致（图4）。

2.2不同生长阶段Mhy7基因表达规律

分析新西兰白兔在生长发育不同阶段背、腿肌Myh7基因的表达规律，从图5可以看出，背肌中Myh7的表达量在1～23周龄这一生长发育时期，所呈现出的波动较大，而在腿肌中Myh7基因的表达量基本处在较低水平；1～9周龄Myh7基因在背肌中的表达量呈现出下降趋势，11周龄Myh7基因的表达量在腿肌中开始出现上升趋势；而腿肌中的表达量在13周龄以后出现下降趋势，最后维持在较低水平，Myh7基因在背肌中表达量相对于腿肌而言总体偏高，且呈现出不规则变化。

3讨论

肌肉的生长发育包含胚胎期肌纤维的形成、出生后肌纤维的发育和成年期肌肉的再生等步骤，是一个复杂的过程。从整体上看，整个过程伴随大量的调控基因在转录组水平和通路水平等多层次的调控，为成肌始祖细胞发育成为适应各种生命过程的终末肌纤维提供保障。这些调控包含成肌调节因子、miRNA、表观遗传、肌肉生长抑制素、GH-IGFs通路、Wnt/β-catenin 通路等[6]。

Myh7基因是肌球蛋白重链家族基因中的一员，肌球蛋白重链家族基因在肌肉的生长发育中扮演重要角色，通过前期差异表达基因筛选，发现Myh7基因与新西兰白兔肌肉发育密切相关。已有研究表明，Myh7基因的突变能够引发人类肥厚型心肌病，30%～50%的家族性肥厚型心肌病由Myh7基因的突变所致[7-9]。王虎等[10]对一个中国人肥厚型心肌病家族进行研究，发现该病与Myh7基因的第14号外显子杂合突变c.1273G>A相关，且携带者的临床表型存在明显差异。Myh7基因nt2025C插入和nt2013c缺失被杨春等[11]在一家族中发现，属国内罕有的移码突变，与该家族肥厚型心肌病患者中存在的致病基因的突变相关。杨忠伟等[12]对3个HCM家族成员进行研究，发现在1个家族中，

Myh7基因14外显子存在Thr441Met突变，该突变首次在我国被发现。故可以通过Myh7基因突变的筛查使提前知晓家族性肥厚型心肌病病变的存在成为可能。

该试验通过生物信息学方法对家兔Myh7基因进行分析研究， 结果表明Myh7蛋白为不稳定亲水性蛋白，有MYSc_class_II和Myosin_N这2个结构区域，其中MYSc_class_II是肌球蛋白重链家族特有结构域。通过MEGA软件对家兔Myh7蛋白进行分子进化分析，发现家禽鸡单独成一个分支，而家兔与人、猩猩等物种间同源性较高，与其亲缘关系远近相一致。利用RT-PCR方法研究了1～23周龄不同生长阶段背、腿肌Mhy7基因的表达规律，结果显示，Mhy7基因在家兔整个生长发育时期因不同部位表现出不完全一致的表达规律，其在腿肌中的表达量基本处在较低的水平；而在背肌中，Mhy7基因的表达量波动较大，提示Myh7基因在背肌中的调控作用更大。在11周龄时出现明显上升，此时背肌和腿肌中Myh7基因的表达量均有上升。该研究初步探索了Mhy7基因在肌肉发育过程中的表达规律，并结合生物信息学方法进行探究，能为研究家兔的肌肉发育分子机制提供一定的参考依据。

安徽农业科学2017年

参考文献

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