乌头和“半蒌贝及”配伍对甲醛致痛模型小鼠镇痛作用的影响❋

汪倩倩，孙丹妮，刘春芳，王 超，王 慧，孙丛丛，何莲花，林 娜△

(1.广州中医药大学, 广州 510006；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

【实验研究】

乌头和“半蒌贝及”配伍对甲醛致痛模型小鼠镇痛作用的影响❋

汪倩倩1，2，孙丹妮2，刘春芳2，王 超2，王 慧2，孙丛丛2，何莲花2，林 娜1，2△

(1.广州中医药大学, 广州 510006；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

目的：考察“半蒌贝及攻乌”反药组合对制川乌镇痛效果的影响并探索相关机制。方法：基于甲醛足底皮下注射致痛模型，检测致痛小鼠给药后2个时相的舔足时间，明确制川乌和法半夏、栝楼、川贝母、浙贝母、白及各单药及1∶1、1∶2和1∶3配伍组合的镇痛效果，并通过联用κ阿片受体激动剂U-69593或拮抗剂Nor-BNI以及ELISA检测致炎足NO、PGE2和TNF-α含量方法，进一步分析相关作用机制。结果：制川乌单用能明显缩短致痛小鼠2个时相的舔足时间，配伍法半夏、栝楼、浙贝母和白及后此作用减弱，呈量效关系。制川乌联用Nor-BNI后可使舔足时间延长至不给药的状态；联用U-69593后舔足时间比之前缩短，再配伍法半夏、白及后舔足时间明显延长；制川乌单用能明显降低甲醛致痛小鼠炎症足中NO、PGE2和TNF-α的含量，配伍法半夏、栝楼、浙贝母和白及后相关因子含量升高。结论：降低乌头的镇痛功效可能是“半蒌贝及攻乌”反药组合相反的具体表现之一，其机制与干扰κ阿片受体活化及增高炎症局部促炎介质含量有关。

乌头反药组合；甲醛致痛；kappa阿片受体；促炎介质

“半蒌贝蔹及攻乌”是中药十八反歌诀的内容之一，但相关禁忌内涵至今尚不明确。本研究团队也曾从妨害治疗的角度，报道了制川乌和各反药配伍“相反”的研究结果[1-4]，发现生半夏能降低制川乌的镇痛抗炎作用，而制川乌则能抑制白蔹的抑菌能力、拮抗栝楼的祛痰作用和降低川贝的镇咳祛痰效果等。本研究拟在前述基础上，以乌头的镇痛功效为药理基础，同步观察制川乌和“半蒌贝及”各反药组合配伍前后对甲醛致痛小鼠镇痛作用的影响，并通过κ阿片受体效应及促炎介质的含量变化来探索相关作用机制，为临床的合理用药及十八反科学内涵的研究提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠，体质量18～22 g，来源于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(动物许可证号 SCXK(军)2012-0004)。

1.2 药材

制川乌产自四川，半夏产自江苏，栝楼产自河北，浙贝母产自浙江，川贝母产自四川，白及产自江苏，均购自北京华邈中药工程技术开发中心。经中国中医科学院中药研究所王孝涛研究员鉴定，分别为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.干燥母根的加工炮制品，天南星科植物半夏Pinelliaternatat(Thunb.)Breit.的干燥块茎，葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim. 或双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms的干燥成熟果实，百合科植物浙贝母F.thunbergiiMiq.和川贝母FritillariacirrhosaD.Don的干燥鳞茎和兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f．的干燥块茎。

1.3 试剂及器材

甲醛(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司(批号 150422)；生理盐水(分析纯)，石家庄四药有限公司(批号 1412261907)；κ阿片受体激动剂U-69593，上海兰浚生物科技有限公司(批号96744-75-1)；κ阿片受体拮抗剂nor-binaltorphimine(Nor-BNI)，上海江莱生物科技有限公司(批号 ab120078)； HF-200 电子天平，赛多利斯公司； SHZ(Ⅲ) 循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司。

2 方法

2.1 药品制备

制川乌分别与半夏、栝楼、浙贝母、川贝母和白及按1∶1、1∶2和1∶3的配比混合后或各药单独加入圆底烧瓶中，加 10 倍量蒸馏水浸泡 1 h；电热套加热，第1煎1.5 h过滤；第 2 煎加 8 倍量的蒸馏水，煎煮 1.5 h过滤，合并 2 次滤液。60℃ 旋蒸浓缩，浓缩至实验所需要体积，-20℃备用。

2.2 动物分组与给药

雄性ICR小鼠，体质量18～22 g，随机分正常组、模型组和不同给药组：制川乌30 min、60 min和90 min组(0.62 g生药/kg，造模前不同时间灌胃给药)，制川乌低、高剂量组(分别为0.31和1.24 g生药/kg，造模前60 min给药)，法半夏/栝楼/浙贝母/川贝母/白及给药组(均为1.86 g生药/kg)，制川乌+法半夏/栝楼/浙贝母/川贝母/白及配伍组(制川乌为0.62 g生药/kg，各反药分别为0.62、1.24和1.86 g生药/kg，造模前60 min给药)，制川乌+Nor-BNI组(皮下注射Nor-BNI 13.6 umol/kg，15 min后灌胃制川乌0.62 g生药/kg，60 min后造模)，U-69593组、U-69593+制川乌组、U-69593+制川乌+法半夏/栝楼/浙贝母/白及组(灌胃生理盐水，或制川乌0.62 g生药/kg，或制川乌与反药1∶3配伍合煎液，15 min后灌胃U-69593 0.32 mg/kg，45 min后造模)。正常对照组和模型组灌胃生理盐水，各给药组灌胃相应药物，给药容积为0.2 ml/10 g。

2.3 模型制备

除正常组外，其他各组小鼠右后足足底皮下缓慢注射20 μl甲醛溶液，制成急性炎性疼痛模型，正常组小鼠右后足足底皮下注射20 μl生理盐水。

2.4 行为学观察

造模后小鼠置于透明的大烧杯中观察，以舔右后足次数为小鼠疼痛反应指标，记录小鼠0～5 min和15～55 min累计添足次数，分别代表第一和第二相疼痛程度。

2.5 炎症足中NO、PGE2和TNF-α含量检测

动物处死后取右后足(踝关节以下并去掉脚趾)，剪刀剪碎置于研钵中，加液氮碾碎至粉末状，再加1 ml低温的PBS(PH为7.4)，用4 ℃离心机12000 r/min离心45 min，取上清ELISA法检测上清中NO、PGE2和TNF-α因子的含量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 制川乌对甲醛致痛小鼠的镇痛作用

表1显示，小鼠甲醛致痛后第一时相的平均舔足时间为82.9 s，第二时相为322.6 s，0.62 g/kg制川乌给药30 min、60 min 和90 min后，两相的舔足时间均明显降低(90 min的第二相除外，P<0.05或P<0.01)，其中60 min作用最显著，且在0.31～1.24 g/kg剂量范围内，随着剂量增高舔足时间缩短(P<0.05或P<0.01)。

组 别鼠数剂量(g/kg)给药时间(min)舔足时间(s)第一相第二相正常组8——00模型组8——82 94±6 24##322 61±30 16##制川乌组80 623043 63±1 37∗∗251 40±10 37∗0 316061 06±2 04∗269 89±27 46∗0 626031 07±3 05∗∗221 40±10 36∗∗1 246026 88±1 33∗∗149 28±6 82∗∗0 629035 35±3 43∗∗298 80±18 93

注：与正常组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01

3.2 制川乌与“半蒌贝及”配伍对甲醛致痛小鼠的镇痛作用

表2显示，与制川乌的作用不同，法半夏、栝楼、浙贝母、川贝母和白及对甲醛致痛小鼠两相的舔足时间均无明显影响(P>0.05)；制川乌配伍0.62、1.24和1.86 g/kg的法半夏、栝楼、浙贝母、白及后，两相的舔足时间较之前明显延长(P<0.05或P<0.01)，呈现剂量依赖性；配伍川贝母后则未见明显变化。

3.3 制川乌与“半蒌贝及”配伍对κ阿片受体激动剂镇痛作用的影响

表3显示，制川乌联用Nor-BNI后舔足时间明显延长(P<0.01)，几近不给药状态；制川乌联用U-69593后舔足时间较之前缩短(P<0.01)，再配伍法半夏、白及后舔足时间延长(P<0.05或P<0.01)，而配伍栝楼、浙贝母则无明显影响(P>0.05)。

组 别鼠数剂量(g/kg)舔足时间(s)制川乌反药第一相第二相模型组8——83 71±7 70332 81±14 21制川乌组80 62—49 62±2 38∗∗234 68±10 12∗∗法半夏配伍组80 620 6263 31±3 17∗∗ΔΔ301 46±15 83∗Δ0 621 2472 91±3 11ΔΔ313 30±17 45ΔΔ0 621 8676 12±3 35ΔΔ329 72±14 28ΔΔ法半夏组8—1 8677 12±3 23320 67±20 77栝楼配伍组80 620 6251 81±3 42∗∗290 63±16 85∗∗Δ0 621 2455 78±6 26∗313 27±24 46∗Δ0 621 8669 97±7 79Δ348 62±31 11Δ栝楼组8—1 8684 30±8 65Δ326 30±16 61ΔΔ浙贝母配伍组80 620 6256 13±3 83∗246 59±16 79∗∗0 621 2478 05±3 85ΔΔ313 58±21 14ΔΔ0 621 8685 79±3 48ΔΔ325 60±26 96ΔΔ浙贝母组8—1 8679 50±4 21298 36±19 23川贝母配伍组80 620 6246 96±6 15∗∗208 12±20 79∗∗0 621 2447 12±4 07∗∗242 40±17 12∗∗0 621 8643 75±6 23∗∗234 86±22 15∗∗川贝母组8—1 8690 31±8 89335 54±29 49白及配伍组80 620 6258 84±6 71297 67±18 91∗0 621 2475 47±4 98Δ372 91±34 85Δ0 621 8674 91±8 48Δ353 39±23 96Δ白及组8—1 8690 29±6 48308 06±18 20

注：与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01；与制川乌组比较:ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

组 别鼠数剂量舔足时间(s)U⁃69593(mg/kg)制川乌(g/kg)反药(g/kg)第一相第二相模型组8———84 20±5 81328 84±15 05制川乌组8—0 62—51 39±3 93∗∗220 95±12 62∗∗Nor⁃BNI组8—0 62—81 21±3 68▲▲280 41±14 51▲▲U⁃69593组80 32——5 46±0 56∗∗101 29±10 93∗∗制川乌联用组80 320 62—4 96±0 67∗∗▲▲96 23±8 26∗∗▲▲法半夏联用组80 320 621 8615 17±1 87ΔΔ137 16±9 45Δ栝楼联用组80 320 621 8610 28±2 56117 06±10 36浙贝母联用组80 320 621 864 53±0 48122 33±10 52白及联用组80 320 621 8625 88±3 65ΔΔ148 42±11 38Δ

注：与模型组比较:**P<0.01；与制川乌组比较:▲▲P<0.01；与U-69593组比较:ΔP<0.05，ΔΔP<0.01(Nor-BNI组皮下注射13.6 μmol/kg Nor-BNI)

3.4 制川乌与“半蒌贝及”配伍对甲醛致痛小鼠炎症足中炎症介质含量的影响

表4显示，致痛小鼠炎症足中NO、PGE2和TNF-α含量较正常小鼠明显升高(P<0.01)，制川乌能明显降低这些炎性介质的含量(P<0.05)，法半夏、栝楼、浙贝母、白及则未见明显变化(P>0.05)；制川乌配伍法半夏、栝楼、浙贝母、白及后，NO、PGE2和TNF-α含量较前明显升高，除法半夏配伍组的NO外，其他比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

4 讨论

甲醛致痛模型是研究炎性疼痛较理想的动物模型之一[5-7]。在甲醛溶液所致急性炎性疼痛的病理过程中，第一相由甲醛直接刺激伤害性感受器所致，为非炎症性疼痛，属于短暂的急性疼痛反应；第二相由局部炎症和伤害性刺激共同产生的炎性致痛物质致腰骶部脊髓中枢敏化，依赖于外周的炎症发展及中枢神经系统参与[5]。制川乌功效祛风除湿、温经止痛，现代药理研究证明其对炎性疼痛具有抑制作用，其机制可能与激活κ阿片受体以及负调节炎症介质有关[8-10]。因此，本研究选择甲醛致痛小鼠作为制川乌及相关反药组合镇痛作用的评估模型，并通过κ阿片受体效应及促炎介质的含量变化来探索相关作用机制。由于制川乌白蔹配伍组对的研究结果之前已有另文报道[11]，这里就不再涉及。

本实验中，采用0.62 g/kg剂量(《中国药典》用量高限的等倍剂量)的制川乌口服给药，可观察到对甲醛致痛小鼠2个时相的镇痛作用，而配伍1、2、3倍剂量的法半夏、栝楼、浙贝母和白及后，制川乌的镇痛效果呈剂量依赖降低，3倍剂量时药效基本被抵消，提示配伍降低制川乌的镇痛作用，可能是“半蒌贝及攻乌”反药组合相反的具体表现之一。相关研究结果与赖晓艺等[11]之前的报道相似。

组别鼠数剂量(g/kg)制川乌反药NO(pmol/mg)PGE2(pg/mg)TNF⁃α(pg/mg)正常组8——30 38±2 14137 19±10 59128 48±6 86模型组8——48 51±2 24##214 53±13 79##165 15±7 19##制川乌组80 62—36 84±2 07∗165 74±11 82∗142 25±6 86∗半夏配伍组80 621 8639 09±1 29189 49±15 55Δ156 56±9 43Δ半夏组8—1 8643 05±1 91179 21±14 28154 54±9 41栝楼配伍组80 621 8642 03±3 26Δ198 68±21 53Δ157 08±3 59Δ栝楼组8—1 8645 71±2 66190 22±13 74172 07±14 22浙贝母配伍组80 621 8646 44±4 25Δ206 76±11 98ΔΔ150 87±27 34Δ浙贝母组8—1 8644 95±3 51179 13±14 62184 70±11 56白及配伍组80 621 8642 25±2 55Δ184 02±15 74Δ157 18±8 71Δ白及组8—1 8642 64±1 90189 89±10 51177 98±11 32

注：与正常组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05；与制川乌组比较:ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

已知κ阿片受体广泛分布于脑内、丘脑内侧、脑室及导水管周围灰质等部位，与痛觉的整合息息有关。本研究中，制川乌对甲醛致痛疼痛小鼠2个时相的镇痛作用既能被κ阿片受体拮抗剂Nor-BNI所抵消，也能被κ阿片受体激动剂U-69593所加强，提示制川乌具有κ阿片受体激动剂样作用。这与本研究团队前期的研究结果一致[8]。U-69593联用制川乌和法半夏、白及反药组合后镇痛作用减弱，提示这2个组合可能具有部分κ阿片受体拮抗剂样作用，这与栝楼、浙贝母的镇痛机制有所不同。

外周组织炎症时能刺激释放自由基和促炎介质，如NO、PGE2和TNF-α等敏化伤害性感受器，通过持续的C纤维刺激致中枢敏化而继发疼痛反应[7]。本研究中，甲醛致痛小鼠炎症足中NO、PGE2和TNF-α的含量异常升高，制川乌给药能明显减少这些促炎介质的含量，但配伍法半夏、栝楼、浙贝母和白及后此作用明显下降。结合上述研究结果提示，法半夏、白及有可能通过中枢和外周等途径干扰制川乌的镇痛功效，而栝楼和浙贝母则可能对外周的影响更明显，相关原因有待日后更深入系统的研究去阐明。

综上本研究发现，制川乌与法半夏、栝楼、浙贝母和白及配伍后对甲醛致痛模型小鼠的镇痛作用下降，是“半蒌贝及攻乌”反药组合相反的具体表现之一，其机制可能与配伍后干扰κ阿片受体活化以及升高炎症局部促炎介质NO、PGE2和TNF-α的含量有关，相关研究将为十八反中乌头与“半蒌贝及”反药组合配伍作用的深入研究提供实验依据。

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Analgesia effect of Contrary Medicine Combination of processedAconitiRadixCoctaandRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,Bulbusfritillariaethunbergli,Bletillastriatain Formalin-induced Pain Mice

WANG Qian-qian1,2, SUN Dan-ni2, LIU Chun-fang2, WANG Chao2, WANG Hui2, Sun Cong-cong2, HE Lian-hua2, LIN Na1,2△
(1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China;2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective: To investigate the analgesic effect and mechanism of the combined administration ofAconitiRadixCoctawithRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,BulbusfritillariaethunbergliorBletillastriatain formalin-induced pain mice. Methods: Formalin was subcutaneously injected into the plantar surface of ICR mice to induce a model with two phases of nociceptive licking responsiveness. The analgesic effects of the different combined administration of traditional Chinese medicine (TCM) andAconitiRadixCoctawere observed. Then the analgesic effects of the combination of antagonist Nor-BNI or κ-opioid receptor agonist U-69593 withAconitiRadixCoctain Formalin-induced pain mice were investigated, and the levels of NO, PGE2and TNF-α in injured skin tissue were detected by ELISA. Results: Compared withAconitiRadixCocta-treatedgroup, the combined administration ofAconitiRadixCoctawithRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,BulbusfritillariaethunbergliorBletillastriataincreased the licking time of two phases in formalin-induced pain mice, with peak at the rate of 1∶3. Nor-BNI could reduce the analgesic effect ofAconitiRadixCocta. The combination ofAconitiRadixCoctaandRhizomapinelliaeorBletillastriatacould partly reduce the analgesic effect of U-69593. Furthermore,AconitiRadixCoctacould significantly reduce levels of NO, PGE2and TNF-α in the skin of inflamed paw, while this effects were significantly decreased when the co-administration withAconitiRadixCoctaandRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,BulbusfritillariaethunbergliorBletillastriata. Conclusion: The analgesic effect ofAconitiRadixCoctawas decreased markedly when the co-administration withAconitiRadixCoctaandRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,BulbusfritillariaethunbergliorBletillastriata. It may be related to the antagonistic action of κ opioid receptor and the decreased anti-inflammatory effect ofAconitiRadixCoctaon NO, PGE2and TNF-α. This study provides the experimental basis for further study on compatibility ofAconitiRadixCoctawithRhizomapinelliae,Fructustrichosanthis,BulbusfritillariaethunbergliorBletillastriata.

Combination ofAconitiRadixCoctawith contrary medicine; Formalin-induced pain model; Kappa opioid receptor; Proinflammatory mediator

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2011CB505300,2011CB505305)-基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究,基于妨害治疗的中药“十八反”配伍基础研究；国家自然科学基金面上项目(81173628)-乌头汤的抗风湿病情改善作用及配伍机制；国家自然科学基金面上项目(81573878)-从脊髓胶质细胞-神经元交互作用探索乌头汤对神经病理性疼痛的镇痛机制；国家自然科学基金重点项目(81630107)-基于病-证-方关联分子网络的寒/热痹经方抗类风湿性关节炎生物学内涵研究

汪倩倩(1992-)，女，安徽人，在读硕士，从事中药药理研究。

△通讯作者：林 娜(1963-)，女，研究员，博士研究生导师，从事中药药性理论与中药药理的研究，E-mail:linna888@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0488-04

2016-09-13