小儿哮喘患者血清中LncRNA BCYRN1的表达及临床意义

冯明玉++韦平++倪琼秀++杨玲蓉

[摘要]目的 探讨LncRNA BCYRN1在小儿哮喘患者血清中的表达及对小儿哮喘病情及预后的影响。方法 选择2012年1月～2015年12月于我院随访的120例稳定期哮喘患儿（间歇发作30例、轻度持续发作30例、中度持续发作30例、重度持续发作30例）和30例健康对照儿童的血清样本，采用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）检测血清中LncRNA BCYRN1与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达水平，分析LncRNA BCYRN1的表达对患儿预后的影响及其与TNF-α、IL-4、IgE的表达的相关性。结果 LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达较健康对照儿童明显增高，LncRNA BCYRN1表达随转归加重呈升高趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。LncRNA BCYRN1随转归加重呈升高趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达成正相关（r=0.712、0.770、0.748，均P<0.001）。结论 LncRNA BCYRN1表达水平与小儿哮喘病情严重程度有关，可作为判断预后的指标，对临床小儿哮喘预后的判断具有一定作用。

[关键词]小儿哮喘；LncRNA BCYRN1；预后

[中图分类号] R725.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（b）-0009-04

Expression and clinical significance of LncRNA BCYRN1 in serum of children with asthma

FENG Ming-yu1 WEI Ping1 NI Qiong-xiu1 YANG Ling-rong2▲

1.Department of Pediatrics，Shuangliu District Hospital of Traditional Chinese Medicine in Chengdu City，Sichuan Province，Chengdu 610200，China；2.Department of Pediatrics，the Third People′s Hospital of Sichuan，Chengdu 610000，China

[Abstract]Objective To investigate the expression of serum LncRNA BCYRN1 in children with asthma and the influence on the situation and prognosis.Methods Serum samples of 120 children with stable asthma from January 2012 to December 2015 in our hospital （including 30 cases of intermittent episodes，30 cases of mild sustained episodes，30 cases of moderate sustained episodes，30 cases of severe persistent episodes） and 30 cases of healthy children as health control were collected.The expression levels of LncRNA BCYRN1 and TNF-α，IL-4，IgE were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and the effect of LncRNA BCYRN1 expression on the prognosis were also analyzed.Meanwhile，the relationship between serum LncRNABCYRN1 expression and inflammatory factors IgE，IL-4 and TNF-α were analyzed.Results The expression of LncRNA BCYRN1 in the serum of asthmatic children was significantly higher than that in the children of health control （P<0.05）.The expression level of LncRNA BCYRN1 increased gradually with the aggravation of the disease （P<0.05）.A positive correlation was also found between LncRNA BCYRN1 expression and inflammatory factors TNF-α，IL-4，IgE （r=0.712，0.770，0.748，all P<0.001）.Conclusion The expression of LncRNA BCYRN1 level associated with children asthma.LncRNA BCYRN1 can be as a predict biomarker of prognosis in children asthma.

[Key words]Children asthma；LncRNA BCYRN1；Prognosis

哮喘是兒童最为常见的慢性炎症性疾病之一，主要以反复发作的气道梗阻、支气管高反应性、气道炎性细胞浸润为主，主要表现为反复发作性喘息、胸闷、咳嗽、胸部紧迫感和气促等症状[1-2]。近年来，小儿哮喘的发病率逐年增加。美国报道其小儿哮喘及喘息症状的发病率高达9.4%（约为7百万），每年哮喘相关的死亡达7000人[3]。香港13～14岁儿童哮喘发病率最高约为11.0%，北京地区高达10.7%，严重影响小儿的身心健康。其发病机制包括遗传因素及环境中的变应原等[4]。目前虽然对于小儿哮喘防治有一些有效的治疗措施，但哮喘发病率依然逐年升高，且哮喘发生的危险因素及其具体机制不清楚。近年来的研究表明，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNAs）在哮喘的发病过程中发挥着重要的作用[5]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，Lnc RNA）是长度在200个核苷酸以上的非编码RNA。近年来的研究主要集中在LncRNA作为癌症的生物标志物，研究发现LncRNA可以作为癌症的早期筛选、诊断、预后评估生物标志物[6-7]。然而关于LncRNA在哮喘中的研究很少，LncRNA对这种不使用病理检验进行诊断的疾病，提供一种在体液中即可进行早期筛选的分子标志物将对哮喘疾病的诊断提供重要意义[8]。研究报道，LncRNA BCYRN1作为microRNA海绵影响支气管平滑肌的功能[9]，然而关于LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达及与临床预后的关系目前国内外尚未见相关报道。本研究将进一步检测正常及哮喘患儿血清中LncRNA BCYRN1的表达，分析其与哮喘早期诊断及临床预后评估的关系。

1对象与方法

1.1对象

选择2012年1月～2015年12月于我院随访的120例稳定期哮喘患儿，其中男65例，女55例；平均年龄（8.3±3.7）岁；间歇发作30例[男性16例，女性14例，平均年龄（8.0±3.2）岁]，轻度持续发作30例[其中男性17例，女性13例，平均年龄（7.9±3.9）岁]，中度持续发作30例[男性18例，女性12例，平均年龄（8.0±4.0）岁]，重度持续发作30例[男性17例，女性13例，平均年龄（8.0±3.0）岁]。同时选择30例健康儿童作为健康对照进行研究，其中男17例，女13例，平均年龄（8.0±4）岁。哮喘患儿与对照组儿童之间性别构成、年龄差异均无统计学意义（P>0.05）。间歇、轻度持续发作、中度持续发作及重度持续发作组患儿年龄、性别构成比之间差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。各组患儿及健康对照儿童之间均无其他基础性疾病及合并症。收集儿童血液标本进一步研究。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患儿的家属均签署了知情同意书。患儿其他情况无特殊。转归及随访治疗2年以上患儿无哮喘发作视为完全缓解。未完全缓解者按照哮喘控制标准[10-11]归类为好转、持续和加重。采用电话及门诊复诊的方法进行随访，电话随访时间为3个月1次，1年随访4次。随访期间120例哮喘患儿中完全缓解28例，好转42例，持续25例，加重25例。纳入标准：①诊断均符合中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的支气管哮喘防治常规诊断标准[12]。②实验前2周内均未使用过茶碱、丙种球蛋白、糖皮质激素、色甘酸钠、白三稀拮抗剂等免疫调节药物。排除标准：①伴有其他心肺疾病患者、患有自身免疫性疾病史、肿瘤等恶性病史的患儿予以排除；②自身过敏及过敏性家族史的患儿予以排除。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理 符合入选标准的患儿分别于首诊时或治疗前24 h内及经过3～6个月的控制治疗后患儿清晨空腹肘静脉血3～5 ml，4℃，3000 r/min，离心10 min，取上层血清。取到上层血清之后加入Trizol混匀后置于-80℃冰箱保存，以备提取RNA。

1.2.2采用雙抗夹心ELISA法测定炎性因子的表达 患儿均在入院的第2天清晨空腹抽静脉血3 ml，置于4℃冰箱内约30 min，血液凝集后3000 r/min，离心15 min，分离血清，取血清，测定患儿的血清4℃水平，采用双抗夹心ELISA法测定TNF-α、IL-4、IgE的表达，具体测定步骤均按照试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）提供的步骤进行。

1.2.3实时荧光定量PCR分析miRNAs的表达 根据Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，采用逆转录试剂盒（Takala，大连宝生生物）和实时荧光定量PCR试剂盒（Takala，大连宝生生物）进行逆转录和PCR扩增。逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μl体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。逆转录反应程序为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。结束后立即将cDNA产物取出，置于-20℃冰箱备用。Real-time PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为摸板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μl体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样，PCR反应在ABI 7500实时定量PCR反应仪上进行，程序为（95℃，3 min）；40 cycles×（95℃ 12 s，62℃ 1 min）；95℃ 15 s。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。3次独立实验后得到的数据运用公式2-△△Ct进行分析。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；非正态分布者组间比较采用Wilcoxon非参数秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis非参数检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 LncRNA BCYRN1在不同哮喘状态及健康对照儿童中的差异的表达

QRT-PCR检测LncRNA BCYRN1在不同哮喘状态患儿以及健康对照儿童血清中的表达，结果显示LncRNA BCYRN1在健康对照儿童中的表达为1.007±0.034，较哮喘患儿中的表达明显降低，LncRNA BCYRN1表达随转归加重呈升高趋势，LncRNA BCYRN1在间歇发作期、轻度持续发作、中度持续发作及中度持续发作期的表达分别为3.750±0.200、5.450±0.450、8.230±0.034、14.890±0.770，与健康对照比较差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。

2.2 LncRNA BCYRN1在不同转归患儿血清中的表达情况

QRT-PCR检测LncRNA BCYRN1在不同转归患儿血清中的表达，结果提示随访2年期间120例哮喘患儿中完全缓解28例（其中男性15，女性13例），好转42例（其中男性20，女性22例），持续25例（其中男性15，女性10例），加重25例（其中男性15，女性10例）。LncRNA BCYRN1随转归加重呈升高趋势，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

2.3 LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子IgE、IL-4和TNF-α的相关性

哮喘患儿血清中LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达成正相关（r=0.712，P<0.001；r=0.770，P<0.001；r=0.748，P<0.001）（图3）。

3讨论

哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，其特征是反复发作性喘息、可逆的气道梗阻和气道重塑。哮喘发生的根本原因尚不明确，治疗以对症治疗为主。哮喘发病机制涉及组织学、分子和基因变化及蛋白表达，近年来非编码RNA（ncRNA）在哮喘病因学的研究中也逐渐受到重视，其可能为哮喘的病理研究和治疗方法带来根本性改变[13-15]。

LncRNA是真核细胞中的一类转录本长度超过200 nt的非编RNA，无蛋白编码功能，在哺乳动物基因组中普遍被转录[16]。LncRNA曾被认为是转录过程中的副产物，不具有生物学功能。但目前越来越多的研究证实LncRNA具有重要的生物学功能，其在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞分化和细胞周期调控等生命活动中发挥重要作用[17-18]。LncRNA具有多样生物学功能：参与X染色体失活，调控mRNA降解，构成细胞核亚结构骨架，作为染色质重塑的调控因子等，并且与人类疾病的发生发展有密切关系[19-21]。研究表明LncRNAs具有多样的生物学功能，其机制主要有染色质重塑、基因印记、细胞周期调控和翻译调控等[22]，然而正因为LncRNAs作用机制的多样性和复杂性，目前对于LncRNAs的作用机制的了解也只是冰山一角，对于其调控与被调控机制仍需要进一步的研究。目前的研究多集中在肿瘤方面，关于LncRNA与小儿哮喘的关系目前国内外报道尚少。本研究选择2012年1月～2015年12月随访的120例稳定期哮喘患儿（间歇发作30例、轻度持续发作30例、中度持续发作30例、重度持续发作30例）和30例健康儿童作为对照进行研究。采集各组研究对象入组时及随访结束时的血清样本采用实时荧光定量PCR检测哮喘患儿及健康对照儿童血清中LncRNA BCYRN1的表达水平，分析LncRNA BCYRN1的表达对患儿预后的影响，重在探讨小儿哮喘中LncRNA的炎症调控机制。结果发现LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达较对照组明显增高，LncRNA BCYRN1随病情加重表达水平逐渐升高，LncRNA BCYRN1随转归加重呈升高趋势，LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達成正相关。

综上所述，LncRNA BCYRN1表达水平与小儿哮喘病情有关，可作为判断预后的指标，对临床小儿哮喘预后的判断具有一定作用。但由于本研究的临床病例有限，关于LncRNA BCYRN1对小儿哮喘的影响尚需扩大样本量及分子生物学实验进一步研究。

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（收稿日期：2017-01-03 本文編辑：任 念）